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目的:弥漫型胃癌（Diffuse Gastric Cancer,DGC）预后差、疗效欠佳,且尚缺乏与免疫治疗相关新靶点。本研究拟通过在DGC上筛选出与免疫相关且特异性高表达的靶点。并针对该靶点制备高亲和力和功能性的单克隆抗体,通过研究该单抗治疗DGC的疗效与机制,从而为DGC治疗开发新的抗体免疫疗法。方法:1.通过非标记定量蛋白组织学（label free）和TCGA数据库等筛选出DGC癌组织与邻近的癌旁组织中与免疫相关且差异表达的基因。通过免疫组化和western blot验证其在DGC癌组织和癌旁组织中蛋白水平表达,并分析该靶点表达水平高低与生存时间的关系;及与免疫检查点PD-L1的关系。2.通过Case 9技术敲除该靶点基因,验证该基因敲除后分别对细胞功能和肿瘤生长的影响。3.利用单细胞测序技术制备针对该靶点的单克隆抗体,并通过BIAcore技术和流式细胞仪技术筛选出高亲和力的单抗,最后并验证其功能。4.利用流式细胞仪和western blot分别验证该单抗对Pro-u PA竞争作用和对ERK信号通路的阻断作用。分别构建该靶点过表达的CDX模型和应用临床样本构建该靶点高表达的PDX模型,通过腹腔给药途径研究针对该靶点的单抗增强PD-1单抗治疗DGC的疗效和其相关机制。结果:1.通过非标记定量蛋白组织学和TCGA数据库进行差异基因分析发现,u PAR和FCGR3A是DGC患者癌组织中与免疫相关且高表达的基因。通过对DGC癌组织和癌旁组织的m RNA水平验证发现,u PAR在癌组织和癌旁组织中差异表达具有统计学意义,则FCGR3A不具备统计学意义。最后分别在8对DGC癌组织蛋白和202对DGC患者组织芯片上验证,发现u PAR在DGC癌组织中蛋白水平表达均明显高于癌旁组织,且u PAR低表达的DGC患者生存时间明显高于u PAR高表达患者,且差异具有统计学意义。在TISIDB数据库中分析发现,u PAR的m RNA表达水平与PD-L1高度相关。2.体外功能实验发现,u PAR-/-组SNU216和AGS细胞增殖能力和侵袭能力均明显低于CTRL组;通过MKN45细胞构建小鼠CDX模型发现,u PAR-/-组的肿瘤组织体积和瘤重均明显低于CTRL组,且通过将u PAR-/-的MKN45细胞进行回复u PAR+/+,发现u PAR-/-+u PAR+/+组肿瘤组织体积和瘤重明显接近于CTRL组。3.通过BIAcore技术分别验证E2和A7单抗与抗原的亲和能力实验,发现E2（αu PAR）抗体亲和能力(Kd=1.95x10-9M)明显高于A7抗体(Kd=9.09x10-8M)。通过免疫荧光和免疫电镜分别验证αu PAR单抗结合能力,发现αu PAR单抗在293T-u PAR+/+细胞和SNU216细胞上与细胞膜上的u PAR抗原具有很强的结合能力。在验证抗体功能性实验中,发现αu PAR单抗在SNU216细胞上具有明显ADCC效应;且αu PAR诱发的CDC效应明显高于同源阴性对照组（Ig G）,其差异具体统计学意义,与人源αHER2抗体CDC效应相同。4.在竞争性结合实验中发现,αu PAR+Pro-u PA组平均荧光强度明显低于单独Pro-u PA组,差异具有统计学意义;且αu PAR+Pro-u PA组中的激活型p-ERK激酶表达量明显低于Pro-u PA+Ig G组,但总T-ERK激酶量无明显变化。通构建CDX模型和PDX模型实验,发现αu PAR治疗组,αPD-1组和αu PAR+αPD-1组肿瘤成像大小和肿瘤体积均明显低于CTRL组,但这三组生存时间也明显高于CTRL组;此外,αu PAR+αPD-1治疗组的肿瘤成像大小和肿瘤体积也均明显低于αPD-1组,但其生存时间也明显高于αPD-1组,差异均具有统计学意义。在免疫荧光、免疫组化和流式细胞仪分析发现,αu PAR组、αPD-1组和αu PAR+αPD-1组这三组肿瘤组织中CD8+T细胞和激活型CD8+T细胞浸润数量均明显高于CTRL组,且αu PAR+αPD-1组肿瘤组织中CD8+T细胞浸润数量也明显高于αPD-1组。此外,对CDX模型肿瘤组织流式分析发现,αu PAR组、αPD-1组和αu PAR+αPD-1组这三组M1型巨噬细胞数明显高于CTRL组,而这三组M2型巨噬细胞和Treg细胞数却明显低于CTRL组。在PDX模型肿瘤组织中验证T cell相关趋化因子的m RNA水平变化,发现αu PAR组中CCL3、CCL4、CXCL10中和αu PAR+αPD-1组中CCL3、CCL4、CXCL9、CXCL10的m RNA表达水平均明显高于CTRL组,差异具有统计学意义。结论:1.u PAR是DGC癌组织中与PD-L1免疫治疗相关且特异性高表达的膜蛋白。2.体内外功能实验验证发现,敲除u PAR基因能抑制DGC增殖和侵袭能力。3.本研究制备了具有较高亲和力和功能性的αu PAR单克隆抗体,对DGC靶向治疗具有潜在价值。4.通过竞争性结合u PAR后阻断u PA-u PAR系统和ERK信号通路来影响DGC细胞增殖、侵袭和黏附。5.αu PAR单克隆抗体不仅能独立提高DGC患者的疗效,而且还能显著增强PD-1抗体在DGC患者中的疗效。6.αu PAR单抗可通过在肿瘤组织中增加CD8+T细胞和M1型巨噬细胞浸润数量,及降低M2型巨噬细胞和Treg细胞浸润数量来抗肿瘤作用;αu PAR单抗可通过诱导T cell相关趋化因子表达来增加T细胞对肿瘤组织浸润数量。