芳香羧酸脱羧酶催化性质及羧化平衡推动的研究

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随着现代化工业进程的发展,煤和石油作为主要能源被使用,燃烧终产物二氧化碳排放到大气中,导致的温室效应已经成为全球最为关注的环境问题。利用生物方法在温和的条件下固定二氧化碳已逐渐成为科学研究的热点。芳香羧酸脱酸酶可以降解芳香羧酸生成芳香烃(主要是苯酚类化合物)和二氧化碳,同时可以催化苯酚类化合物与二氧化碳反应生成有价值的芳香羧酸,酶促反应可以在常温下进行,且不需要加入ATP及辅因子。  本文工作通过挖掘基因数据库得到了三个新的芳香羧酸脱羧酶,并验证了其催化可逆性。结合已报道的三个芳香羧酸脱羧酶,研究了这六个酶对水杨酸衍生物相对活性,发现不同来源的芳香羧酸脱羧酶有不同的底物偏好性,可以分为水杨酸脱羧酶和2,6-二羟基苯甲酸脱羧酶两大类。来源于真菌的水杨酸脱羧酶可以作用于水杨酸而对2,6-二羟基苯甲酸没有偏好性。来源于细菌的水杨酸脱羧酶不能作用于水杨酸,却对2,6-二羟基苯甲酸有明显高的相对酶活。取代基对酶活有巨大影响,3位和6位取代基与酶分子中氨基酸残基形成氢键对酶活有巨大的提升。4位上共轭给电子的取代基对酶活有一定的促进作用,而5位取代基对酶活有明显的抑制作用。  测定了六种芳香羧酸脱羧酶对不同取代苯酚的羧化反应转化率,通过设计可逆脱羧对照反应,估算了羧化反应的平衡常数及吉布斯自由能,证实了羧化反应的热力学平衡确实是对羧化方向不利的。  为了提高羧化反应转化率,以勒夏特列原理为指导思想,寻找到了能够沉淀芳香羧酸而不沉淀碳酸氢根的沉淀剂——季胺盐,向酶法羧化体系中加入合适的季胺盐将生成的水杨酸化合物沉淀出来,成功地推动了可逆反应向羧化方向移动。对于间苯二酚的羧化反应,转化率由原来的37%提升到高于99%,且酶促羧化反应的底物浓度可以达到200 mM;对于邻苯二酚的羧化反应,转化率由原来的36%提升到95%以上。完成了220 mg规模的间苯二酚羧化反应,并初步研究了产物后处理的方法。对芳香羧酸脱羧酶的固定化进行了初步的研究,伯氨基树脂固定化酶有良好的回收率、酶活及稳定性,固定化酶催化的间苯二酚的羧化反应可以实现碳酸氢钾的循环连续利用。对芳香羧酸脱羧酶的催化杂交性质展开了研究,水杨酸脱羧酶可以催化不同取代基的邻羟基苯硼酸的脱硼反应,生成相应的取代苯酚,不同的水杨酸脱羧酶对脱硼和脱羧反应有不同偏好性。这是首次发现芳香羧酸脱羧酶对有机硼化合物的降解作用。  通过对芳香羧酸脱羧酶的催化性质及羧化平衡展开研究,发现芳香羧酸脱羧酶的底物偏好性及催化杂交性,推动了反应平衡向羧化方向移动,为二氧化碳的高值化利用和芳香羧酸的绿色合成提供了新途径。
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