论文部分内容阅读
目的：应用RNA干扰(RNAi)方法沉默人急性T淋巴母细胞白血病细胞MOLT-4细胞组蛋白赖氨酸特异性脱甲基酶1(LSD1)基因的表达，研究LSD1基因被与之对应的小干扰RNA沉默后，MOLT-4细胞的增殖、凋亡以及对组蛋白甲基化、乙酰化修饰及DNA甲基化修饰的影响。方法：(1)针对LSD1基因设计4个相对应的siRNA片段,使用LipofectamineTM2000将这四个片段分别转染进Molt-4细胞，随之采用RT-PCR方法筛选出最佳的siRNA片段。（2）应用MTS法检测LSD1siRNA对MOLT-4细胞增殖的影响；采用流式细胞术分析细胞的凋亡。（3）Western blot法检测组蛋白H3K4、H3K9甲基化及组蛋白H3乙酰化状态的变化以及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白P15、甲基转移酶DNMT1和Bcl-2、procaspase-3等凋亡相关蛋白表达水平的变化。结果：（1）转染6小时后，转染率较好，采用RT-PCR法筛选出最佳的siRNA为sense5’-CCACGAGUCAAACCUUUAUTT-3’； Anti-sense5’-AUAAAGGUUUGACUCGUGG TT-3’。（2）LSD1siRNA抑制MOLT-4细胞的增殖，LSD1siRNA0、30、60、120nM转染24小时后细胞增殖率分别为（99.35±1.38）%，（83.02±1.69）%，（65.72±2.16）%，（41.15±2.23）%，p＜0.05；60nM的LSD1siRNA转染0、24、48、72小时后细胞增殖率为（99.86±1.35）%，（65.72±2.16）%，（48.26±1.92）%，（37.86±1.66）%，p＜0.05，呈时间和浓度依赖性。（3）LSD1siRNA致凋亡相关蛋白Bcl-2、procaspase-3的表达下降，出现细胞凋亡，LSD1siRNA60、120、240μMol作用24小时后，MOLT-4细胞的凋亡率分别为(12.16±1.74)%、(32.74±2.47)%、(54.64±2.58)%，而对照组为(3.35±1.26)%，凋亡率随着LSD1siRNA浓度的增加逐渐上升,p＜0.05。（4）LSD1siRNA抑制LSD1蛋白及LSD1mRNA，上调组蛋白H3K4一甲基化、二甲基化及组蛋白H3的乙酰化水平，H3K4三甲基化、H3K9甲基化水平无显著变化。(5)LSD1siRNA下调DNA去甲基化酶DNMT1的表达，上调P15的表达。结论:(1)应用RNAi技术，LSD1siRNA可有效地干扰MOLT-4细胞LSD1基因的表达。(2) LSD1siRNA可使细胞增殖率减低并且增加细胞凋亡。(3) LSD1基因被LSD1siRNA介导的基因“敲低”后，MOLT-4细胞中的组蛋白甲基化H3K4一甲基化、二甲基化、组蛋白H3乙酰化表达增强，重新启动基因转录。但对组蛋白甲基化H3K4三甲基化、H3K9甲基化表达水平并没有影响。（4）LSD1siRNA抑制DNA去甲基转移酶1（DNMT1）表达，使P15基因从新表达。RNA干扰技术有望成急性淋巴细胞白血病靶向治疗的工具，LSD1可能成为治疗的新靶点。