【摘 要】
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油菜是我国种植最广的油料作物之一。目前我国仍需进口油菜籽以填补国内消费市场需求。因此,加快我国优质高产油菜的育种工作进程尤为重要。本研究开发了一款高密度的SNP育种芯片（Bnapus50K芯片）,用于快速、通用的基因分型,服务于甘蓝型油菜基因组育种和研究。甘蓝型油菜pol细胞质不育系根据其温敏特性已成功应用于两系制种,克隆温敏基因用以辅助温敏材料的育种改良,解析温敏发生的分子机制尤为重要。本研究进
【基金项目】
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国家自然科学基金（GrantNo.31871701）； 国家重点研发计划（2016YFD0101300、2016YFD0100804、2017YFD0102004）；
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油菜是我国种植最广的油料作物之一。目前我国仍需进口油菜籽以填补国内消费市场需求。因此,加快我国优质高产油菜的育种工作进程尤为重要。本研究开发了一款高密度的SNP育种芯片（Bnapus50K芯片）,用于快速、通用的基因分型,服务于甘蓝型油菜基因组育种和研究。甘蓝型油菜pol细胞质不育系根据其温敏特性已成功应用于两系制种,克隆温敏基因用以辅助温敏材料的育种改良,解析温敏发生的分子机制尤为重要。本研究进一步利用了油菜芯片对pol CMS温敏基因进行定位,同时使用RNA-seq和Iso-seq分析不同温度下pol温敏不育系的基因表达情况,以解析温度调控pol CMS育性转变的机制。主要研究结果如下:1.油菜育种芯片的设计:本研究基于油菜60K芯片探针、505份甘蓝型油菜重测序数据和重要功能基因序列,设计开发了一款甘蓝型油菜Illumina 50K SNP芯片,命名为Bnapus50K芯片。该芯片的探针在染色体上均匀分布,其中包含1,618条特异性探针,涉及转基因、育性、开花期、抗病和含油量等相关基因/QTLs。使用甘蓝型油菜144个栽培品种、27个亲本及其组合的21个F1作为Bnapus50K芯片检测的测试材料,建立适用于异源四倍体油菜且包含28,509条高质量探针的cluster文件。2.Bnapus50K芯片的检测性能:测试样品的检测结果显示,大部分探针都具良好的检测效率,其中转基因探针的检出转基因灵敏度的百分比含量下限为3.3%。本研究使用Bnapus50K芯片对具有不同亲缘关系的品种进行了鉴定,结果显示芯片在品种鉴定方面具有实用价值;联合集团混合分析法和芯片基因分型法对已克隆基因Rfp进行定位,筛选到的差异标记主要位于Rfp基因座附近,说明芯片在基因定位方面也具有很高的利用价值。3.芯片在温敏基因定位中的应用:本研究对pol温敏不育系596与pol稳定不育系1318杂交后代F2群体进行表型考察,发现群体内单株育性呈连续分布的特征,说明pol CMS低温育性回复性状受多位点控制。通过对亲本和BC1分离群体中的极端表型单株混池进行芯片检测,在A07染色体上检测到一个温敏性状相关的主效位点,利用重测序分析和多态性分子标记扫描BC群体验证了该结果。对F2群体的90个单株进行Bnapus50K芯片分型检测分析,在scaffold A08染色体扫描到一个QTL,可解释18.1%的表型变异,利用多态性分子标记对F2群体进行扫描验证了该结果。最终,本研究使用DNA芯片找到控制温敏不育的位点位于scaffold A07（1.092 Mb-3.379 Mb,7.048 Mb-10.588 Mb）和scaffold A08（12.900 Mb-14.192 Mb）染色体上。4.pol温敏不育系的表型观察:在低温（16℃）条件下,波里马温敏不育系596的花药发育正常,花粉粒可被1%醋酸洋红染液着色;高温（25℃）条件下,596花药相对较短,且不能产生有活力的花粉。通过半薄切片对不同温度下花药组织进行细胞学观察,发现温敏不育系的不育发生时期与稳定不育系的发生时期一致,皆为花药发育3-4期,即孢原细胞分化时期。5.RNA-seq测序分析:对16℃条件下生长的596和1318及25℃条件下生长的596的小花蕾（＜1mm,不育发生时期）进行RNA-seq。分析发现,相比不育花蕾（596-H,1318）,可育花蕾（596-L）中有1,038个的差异上调表达基因和599个差异下调表达基因。对可育与不育样品间的差异表达基因进行GO富集分析,发现这些基因主要参与各种代谢过程,主要行使离子结合的功能。进一步对线粒体功能相关基因的转录本进行分析,发现低温下的花蕾中存在一个包含不育基因orf224 3’端357 nt的orf224/atp6共转录本;非磷酸化呼吸途径相关的基因在可育花蕾中上调表达,而线粒体解偶联剂（FCCP）处理花蕾的结果表明线粒体内氧化还原水平的平衡对花药发育起重要作用。此外,部分ROS响应相关的热激转录因子在不同样品间差异表达,硝基蓝四唑染色结果显示低温时596中ROS积累最低。6.Iso-seq测序分析:对两种温度下生长的596小花蕾的总RNA进行全长转录组测序,鉴定到了一些新的全长转录本,融合基因和lnc RNA。转录本可变剪切分析结果表明,环境温度升高增加了小花蕾中的可变剪切类型和数量。对在不同温度下特异发生可变剪切事件的基因分别进行GO和KEGG富集分析,发现这些基因在低温时主要参与各种代谢过程,高温时则主要参与遗传信息处理过程。7.温敏候选基因预测:在定位候选区间内,综合基因DNA水平变异情况、RNA水平表达情况及蛋白注释情况进行筛选,认为Bna A07G0016300ZS,Bna A07G0027800ZS,Bna A07G0034100ZS,Bna A08G0072900ZS和Bna A08G0075100ZS五个基因可能是pol TCMS育性转换相关的候选基因。
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