论文部分内容阅读
扬子鳄(Alligator sinensis)是我国特有的一种小型鳄鱼，因其野外种群数量稀少而被我国列为国家一级重点保护动物，并在安徽宣城建立了扬子鳄繁殖研究中心进行人工养殖研究。目前，对扬子鳄摄食与生长的内分泌调控机制尚知之甚少。研究表明，食欲素(Orexin)、胃促生长素(Ghrelin)和胃泌素释放肽(GRP)在脊椎动物的食欲调节中发挥重要作用，本实验首次对这3种食欲调节激素及其受体(Orexin和OX2R、Ghrelin和GHSR、GRP和GRPR)的分子结构特征及其在活动期和冬眠期的时空表达变化进行了研究，旨在增进对扬子鳄摄食内分泌调控的认识，为其人工养殖技术的发展提供基础资料。
扬子鳄前Orexin原cDNA全长为2024bp，其中包括一个1358bp的5’-UTR(5’端非翻译区)，一个189bp的3’-UTR(3’端非翻译区)和一个477bp的ORF(开放阅读框)，ORF编码158个氨基酸，包含26个氨基酸的信号肽，33个氨基酸的OrexinA、28个氨基酸的OrexinB和C末端64个氨基酸的功能未明序列。扬子鳄OX2R的cDNA全长为1504bp，包括一个12bp的5’-UTR，一个19bp的3’-UTR和一个1473bp的ORF，ORF编码一个由501个氨基酸残基组成的七次跨膜蛋白。多重序列比对(Multiple sequence alignment, MSA)分析表明，扬子鳄OrexinA和OrexinB都与密西西比鳄和鸟类有较高的同源性，受体OX2R与密西西比鳄的同源性最高，与哺乳动物和鸟类的同源性较高。系统发育进化树(Phylogenetic trees, PT)分析结果显示，扬子鳄的前Orexin原与OX2R均与密西西比鳄和鸟类的亲缘关系最为接近。逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)结果显示，前Orexin原在中枢和外周组织中广泛表达，中枢组织以中脑、下丘脑的表达量最高，外周组织中，心、肺、肾、肠道、卵巢、输卵管和肌肉中的表达量较高；OX2R在大脑和中脑表达量较高，下丘脑、小脑、延脑则次之，外周组织中则只在卵巢中检测到很高的表达量，其他组织表达量非常低。荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR, Q-PCR)结果显示，冬眠期，前Orexin原在中枢各组织中的表达水平均极显著升高(P＜0.01)，脾脏和胰腺的表达水平亦极显著升高(P＜0.01)，肾、卵巢、肌肉表达水平则极显著降低，输卵管表达水平显著降低(P＜0.05)；OX2R在中枢组织的表达均极显著增加(P＜0.01)，而外周组织中卵巢的表达量极显著减少。前Orexin原及其受体OX2R在活动期和冬眠期的组织表达谱表明它们可能在扬子鳄的摄食和生殖调节中发挥重要作用。
扬子鳄GhrelincDNA全长为1770bp，由一个37bp的5’-UTR?一个435bp的ORF和一个1298bp的3’-UTR组成，ORF编码一个由145个氨基酸残基组成的Ghrelin前体原，包含N端的52个氨基酸残基的信号肽，紧随其后的28个氨基酸残基的成熟肽，C端的103~126肽段(可能是Obestain)。受体GHSRcDNA序列全长为3961bp，包括375bp的5’-UTR、2527bp的3’-UTR和1059bp的ORF，ORF编码352个氨基酸残基，结构分析显示GHSR属七次跨膜蛋白，有七个跨膜结构域，含有多个保守的N糖基化位点和半胱氨酸残基(C)位点。多重序列比对分析表明扬子鳄Ghrelin前体原及受体GHSR都与密西西比鳄和鸟类具有较高的同源性；系统发育进化树分析表明，扬子鳄和密西西比鳄以及鸟类亲缘关系最为接近。RT-PCR实验结果表明扬子鳄Ghrelin前体原在中枢组织的大脑、中脑和下丘脑表达量较高，外周组织中肺、胃和肠的表达量相对较高，而心、肾的表达量相对较低，其他组织中未见表达；受体GHSR在中枢组织的五个脑部的表达量都非常高，在外周组织中，肺、肾和输卵管的表达量较高，心、胃和肠的表达量相对较低，其他组织均只有微量表达。Q-PCR实验结果显示，冬眠期，Ghrelin前体原在中枢组织5个脑部的表达量均极显著增高(P＜0.01)，外周组织中胃和肠道的表达量极显著降低，而肝脏、肺、胰腺、卵巢和输卵管的表达量显著降低(P＜0.05)；GHSR在中枢组织中的表达变化与Ghrelin前体原相一致，外周组织中心、肾、胃和卵巢的表达量极显著降低(P＜0.01)，其他组织显著降低(P＜0.05)。扬子鳄Ghrelin及其受体GHSR在活动期和冬眠期的表达变化，表明其不仅可能调节扬子鳄的摄食，而且参与心血管、胃肠道和生殖功能的调节。
扬子鳄GRPcDNA序列长为852bp，包括一个529bp的ORF和一个323bp的3’-UTR，ORF编码176个氨基酸残基，其中成熟肽由27个氨基酸残基组成，其C末端存在一段完全保守的氨基酸序列MGKKS。受体GRPRcDNA全长为2210bp，由97bp的5’-UTR、949bp的3’-UTR和1164bp的ORF组成，ORF编码388个氨基酸残基，结构分析显示GRPR属七次跨膜蛋白，含七个保守跨膜结构域。多序列比对分析表明，扬子鳄GRP及受体GRPR均与密西西比鳄的同源性最高，与哺乳动物和鸟类的同源性高于两栖类和鱼类；系统发育进化树分析显示扬子鳄GRP和受体GRPR均与密西西比鳄同属一支，与爬行动物和鸟类聚为一簇，而与哺乳动物和鱼类的亲缘关系则较远。RT-PCR结果表明，扬子鳄GRP在中枢组织中，大脑和下丘脑的表达量最高，中脑、小脑和延脑则只有微量表达，外周组织的脾脏、肺、肾脏和输卵管表达量较高，卵巢中表达量次之，而胃、肠道和胰腺的表达量较低；GRPR在中枢组织包括大脑、中脑、下丘脑和延脑的表达量较高，而小脑的表达量较低，外周组织中肺、肠道的表达量相对较高，而胃、胰腺、卵巢和肌肉的表达量较低，其他组织未见表达。Q-PCR结果显示，冬眠期，GRP在中枢组织各部位的表达量均极显著降低(P＜0.01)，外周组织的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、胃、卵巢和输卵管的表达量均极显著降低(P＜0.01)，而肌肉的表达量极显著增加；GRPR中枢组织中表达水平除小脑显著降低外其余脑部均极显著降低，外周组织的心、脾、肺、肾、胃的表达水平极显著降低(P＜0.01)，输卵管的表达水平极显著增加，卵巢的表达水平显著增加(P＜0.05)。扬子鳄GRP及其受体GRPR在活动期和冬眠期的组织表达谱表明它们可能在扬子鳄的摄食和胃酸的分泌中发挥重要调节作用。
本研究增进了对扬子鳄3种食欲调节激素及其受体(Orexin和OX2R、Ghrelin和GHSR、GRP和GRPR)的分子结构和系统进化的了解，加深了对于扬子鳄摄食、消化、生殖等方面内分泌调控的认识，为扬子鳄人工养殖技术的发展提供了基础资料。
扬子鳄前Orexin原cDNA全长为2024bp，其中包括一个1358bp的5’-UTR(5’端非翻译区)，一个189bp的3’-UTR(3’端非翻译区)和一个477bp的ORF(开放阅读框)，ORF编码158个氨基酸，包含26个氨基酸的信号肽，33个氨基酸的OrexinA、28个氨基酸的OrexinB和C末端64个氨基酸的功能未明序列。扬子鳄OX2R的cDNA全长为1504bp，包括一个12bp的5’-UTR，一个19bp的3’-UTR和一个1473bp的ORF，ORF编码一个由501个氨基酸残基组成的七次跨膜蛋白。多重序列比对(Multiple sequence alignment, MSA)分析表明，扬子鳄OrexinA和OrexinB都与密西西比鳄和鸟类有较高的同源性，受体OX2R与密西西比鳄的同源性最高，与哺乳动物和鸟类的同源性较高。系统发育进化树(Phylogenetic trees, PT)分析结果显示，扬子鳄的前Orexin原与OX2R均与密西西比鳄和鸟类的亲缘关系最为接近。逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)结果显示，前Orexin原在中枢和外周组织中广泛表达，中枢组织以中脑、下丘脑的表达量最高，外周组织中，心、肺、肾、肠道、卵巢、输卵管和肌肉中的表达量较高；OX2R在大脑和中脑表达量较高，下丘脑、小脑、延脑则次之，外周组织中则只在卵巢中检测到很高的表达量，其他组织表达量非常低。荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR, Q-PCR)结果显示，冬眠期，前Orexin原在中枢各组织中的表达水平均极显著升高(P＜0.01)，脾脏和胰腺的表达水平亦极显著升高(P＜0.01)，肾、卵巢、肌肉表达水平则极显著降低，输卵管表达水平显著降低(P＜0.05)；OX2R在中枢组织的表达均极显著增加(P＜0.01)，而外周组织中卵巢的表达量极显著减少。前Orexin原及其受体OX2R在活动期和冬眠期的组织表达谱表明它们可能在扬子鳄的摄食和生殖调节中发挥重要作用。
扬子鳄GhrelincDNA全长为1770bp，由一个37bp的5’-UTR?一个435bp的ORF和一个1298bp的3’-UTR组成，ORF编码一个由145个氨基酸残基组成的Ghrelin前体原，包含N端的52个氨基酸残基的信号肽，紧随其后的28个氨基酸残基的成熟肽，C端的103~126肽段(可能是Obestain)。受体GHSRcDNA序列全长为3961bp，包括375bp的5’-UTR、2527bp的3’-UTR和1059bp的ORF，ORF编码352个氨基酸残基，结构分析显示GHSR属七次跨膜蛋白，有七个跨膜结构域，含有多个保守的N糖基化位点和半胱氨酸残基(C)位点。多重序列比对分析表明扬子鳄Ghrelin前体原及受体GHSR都与密西西比鳄和鸟类具有较高的同源性；系统发育进化树分析表明，扬子鳄和密西西比鳄以及鸟类亲缘关系最为接近。RT-PCR实验结果表明扬子鳄Ghrelin前体原在中枢组织的大脑、中脑和下丘脑表达量较高，外周组织中肺、胃和肠的表达量相对较高，而心、肾的表达量相对较低，其他组织中未见表达；受体GHSR在中枢组织的五个脑部的表达量都非常高，在外周组织中，肺、肾和输卵管的表达量较高，心、胃和肠的表达量相对较低，其他组织均只有微量表达。Q-PCR实验结果显示，冬眠期，Ghrelin前体原在中枢组织5个脑部的表达量均极显著增高(P＜0.01)，外周组织中胃和肠道的表达量极显著降低，而肝脏、肺、胰腺、卵巢和输卵管的表达量显著降低(P＜0.05)；GHSR在中枢组织中的表达变化与Ghrelin前体原相一致，外周组织中心、肾、胃和卵巢的表达量极显著降低(P＜0.01)，其他组织显著降低(P＜0.05)。扬子鳄Ghrelin及其受体GHSR在活动期和冬眠期的表达变化，表明其不仅可能调节扬子鳄的摄食，而且参与心血管、胃肠道和生殖功能的调节。
扬子鳄GRPcDNA序列长为852bp，包括一个529bp的ORF和一个323bp的3’-UTR，ORF编码176个氨基酸残基，其中成熟肽由27个氨基酸残基组成，其C末端存在一段完全保守的氨基酸序列MGKKS。受体GRPRcDNA全长为2210bp，由97bp的5’-UTR、949bp的3’-UTR和1164bp的ORF组成，ORF编码388个氨基酸残基，结构分析显示GRPR属七次跨膜蛋白，含七个保守跨膜结构域。多序列比对分析表明，扬子鳄GRP及受体GRPR均与密西西比鳄的同源性最高，与哺乳动物和鸟类的同源性高于两栖类和鱼类；系统发育进化树分析显示扬子鳄GRP和受体GRPR均与密西西比鳄同属一支，与爬行动物和鸟类聚为一簇，而与哺乳动物和鱼类的亲缘关系则较远。RT-PCR结果表明，扬子鳄GRP在中枢组织中，大脑和下丘脑的表达量最高，中脑、小脑和延脑则只有微量表达，外周组织的脾脏、肺、肾脏和输卵管表达量较高，卵巢中表达量次之，而胃、肠道和胰腺的表达量较低；GRPR在中枢组织包括大脑、中脑、下丘脑和延脑的表达量较高，而小脑的表达量较低，外周组织中肺、肠道的表达量相对较高，而胃、胰腺、卵巢和肌肉的表达量较低，其他组织未见表达。Q-PCR结果显示，冬眠期，GRP在中枢组织各部位的表达量均极显著降低(P＜0.01)，外周组织的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、胃、卵巢和输卵管的表达量均极显著降低(P＜0.01)，而肌肉的表达量极显著增加；GRPR中枢组织中表达水平除小脑显著降低外其余脑部均极显著降低，外周组织的心、脾、肺、肾、胃的表达水平极显著降低(P＜0.01)，输卵管的表达水平极显著增加，卵巢的表达水平显著增加(P＜0.05)。扬子鳄GRP及其受体GRPR在活动期和冬眠期的组织表达谱表明它们可能在扬子鳄的摄食和胃酸的分泌中发挥重要调节作用。
本研究增进了对扬子鳄3种食欲调节激素及其受体(Orexin和OX2R、Ghrelin和GHSR、GRP和GRPR)的分子结构和系统进化的了解，加深了对于扬子鳄摄食、消化、生殖等方面内分泌调控的认识，为扬子鳄人工养殖技术的发展提供了基础资料。