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视网膜变性疾病是以视网膜神经节细胞、双极细胞、感光细胞、色素细胞等进行性变性、凋亡、坏死的一类疾病,主要包括视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa,RP）、年龄相关性黄斑变性（Age-related macular degeneration,AMD）、视锥视杆细胞发育不良、Stargardt病等。目前针对这类疾病,主要是对症治疗及缓解视网膜细胞变性、凋亡进展。到目前为止,还没有有效阻止病变进展和恢复视网膜功能的治疗方法。干细胞（Stem cell,SC）是高等多细胞生物体内具有自我更新及多向分化潜能的未分化或低分化细胞,其作为组织细胞再生的理想种子细胞,在视网膜变性性疾病中的研究应用具有其独特优势。干细胞治疗视网膜退行性疾病主要通过补充、替换已变性坏死的视网膜细胞。亦可以经由干细胞通过旁分泌机制刺激残存细胞活性,包括可分泌多种神经营养因子,如睫状神经营养因子（Ciliary neurotrophic factor,CNTF）、脑源性神经营养因子（Bone derived neurotrophic factor,BDNF）、碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor,bFGF）等,并在受损视网膜的微环境中表达上调,促进变性视网膜组织修复,发挥保护作用。睫状神经营养因子（CNTF）是众多视网膜神经保护因子之一,目前研究表明,CNTF主要对视网膜神经节细胞具有保护作用。亦有研究表明其对视网膜色素上皮细胞、光感受器细胞同样具有保护作用。本研究拟通过尾静脉注射NaIO3（碘酸钠）造成视网膜变性大鼠模型,予视网膜变性大鼠玻璃体腔内注射CNTF基因修饰慢病毒转染骨髓间充质干细胞,以明确转染CNTF骨髓间充质干细胞对视网膜变性保护作用。第一部分碘酸钠致SD大鼠视网膜变性及CNTF表达研究目的:通过尾静脉注射NaIO3造成SD大鼠视网膜变性模型,初步了解碘酸钠至视网膜形态及电生理变化,明确CNTF在碘酸钠致大鼠视网膜变性表达情况。方法:应用NaIO3（50mg/kg）经尾静脉注射,造成大鼠视网膜变性建立视网膜变性大鼠模型,随机分为实验组（1D;3D;1W;2W;4W）及对照组,每组6只。于各时间段行F-ERG检测视网膜功能;各时间段取眼球行HE染色观察视网膜形态,石蜡切片TUNEL染色观察视网膜各层凋亡情况,免疫组化染色观察CNTF在视网膜各层表达情况;各时间段取眼球视网膜,行RT-PCR检测CNTF表达情况。结果:1.各组大鼠实验前暗适应视杆细胞反应（Rod-R）的b波潜伏期及振幅、暗适应最大反应（Max-R）b波潜伏期及振幅差异均无统计学意义（P>0.05）。与正常组相比,碘酸钠注射后3D开始各大鼠即出现暗适应Rod-R的b波均明显潜伏期延长、振幅下降;暗适应Max-R的b波潜伏期延长及振幅下降。2.HE染色示:与正常组相比较,经碘酸钠注射1D后即出现视网膜RPE细胞肿胀凋亡,形态改变;致第3D视网膜RPE层细胞凋亡殆尽,IS/OS层结构疏松,外核层细胞排列疏松紊乱,视网膜水肿增厚;致第1W视网膜进一步水肿增厚,外核层、内核层均结构紊乱,呈波浪样凸起,结构疏松,REP层至外核层可见部分小细胞增生;第2W外核层结构紊乱,密度减少,伴随小细胞增殖;第4W视网膜变薄,以后极部明显,外核层、内核层变薄,结构紊乱结构疏松。3.TUNEL染色结果:正常鼠视网膜各层凋亡细胞极少,于碘酸钠注射后第1天视网膜色素上皮层出现TUNEL染色加深细胞开始出现坏死;至第三天RPE层出现明显细胞凋亡坏死;于第1W出现RPE层细胞凋亡殆尽,细胞凋亡累及外核层;第2W外核层细胞凋亡明显;第4W出现外核层细胞凋亡聚集呈片、内核层亦出现明显细胞凋亡。4.RT-PCR结果显示,与正常组比较碘酸钠注射1D后CNTF表达无明显异常（P>0.05）,在注射3D后CNTF表达量呈上升趋势,与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05）,随着时间的延长,CNTF表达在注射后1W达最高水平,约为正常对照组4.53倍,随后CNTF表达量进行性下降,在注射后4W达与正常组比较差异无统计学意义（P>0.05）,且呈相对低表达状态。5.免疫组化结果显示正常成年SD大鼠视网膜CNTF主要表达于神经节细胞层及外核层处,RPE细胞CNTF染色亦呈阳性。CNTF随碘酸钠作用时间的延长外核层表达逐渐上调,亦可见部分增生胶质细胞表达,在损伤1W时外核层细胞CNTF表达阳性率最高,随后CNTF表达呈下降趋势,于增生处明显聚集成团。结论:碘酸钠作为一种无机氧化剂可以选择性造成SD大鼠视网膜色素上皮细胞损伤,继而导致视网膜光感受器细胞等组织细胞的损伤,主要损伤视网膜外层。组织形态上表现为视网膜色素上皮细胞在最初的损伤中,细胞数减少,继而完全丢失;随即出现视网膜外核层细胞的损伤凋亡,出现细胞排列紊乱和轻度的波浪状改变,随时间的增加,这种改变加重,且外核层细胞减少明显,外核层变薄。碘酸钠的作用时间越长,损伤越重。CNTF在碘酸钠致视网膜变性过程初处于相对过表达状态,以视网膜外核层明显,在损伤后1W处于最高水平,随后其表达水平下降。应用SD鼠NaIO3（50mg/kg）经尾静脉注射,可以很好模拟视网膜变性过程,碘酸钠致大鼠视网膜细胞变性凋亡与CNTF分泌水平相关。第二部分CNTF基因修饰骨髓间充质干细胞对大鼠视网膜变性保护作用研究目的:通过对视网膜变性SD大鼠玻璃体腔注射经CNTF基因修饰骨髓间充质干细胞,初步了解CNTF转染骨髓间充质干细胞对大鼠视网膜变性保护作用。方法:于NaIO3（50mg/kg）造模第7天,随机分为对照组、伪手术组（DMEM组）、CNTF组、GFP组;对照组为未注射,伪手术组行玻璃体腔注射DMEM,CNTF组行玻璃体腔注射经CNTF-GFP基因修饰骨髓间充质干细胞,GFP组行玻璃体腔注射经GFP基因修饰骨髓间充质干细胞。各于各时间段（注射后3D、1W、2W、4W、8W）行F-ERG检测视网膜功能;各时间段取眼球行HE染色观察视网膜形态;注射后2W、8W石蜡切片TUNEL染色观察视网膜各层凋亡情况,荧光显微镜观察GFP纵向分布情况;注射后2W取各组眼球视网膜组织,行RT-PCR检测Caspase3表达情况;注射后2W、8W取各组眼球视网膜铺片,荧光显微镜观察GFP视网膜面分布情况。结果:1.ERG结果:CNTF组于注射后3D、1W、2W、4W、8W暗适应Max-R的b波潜伏期差异具有统计学意义（F=4.446,P<0.05）,呈波状,于注射后2W呈最低水平;暗适应Max-R的b波振幅差异具有统计学意义（F=2.984,P<0.05）,呈峰状,于注射后2W呈最高水平。于注射后2W,CNTF组与GFP组较对照组及DMEM组暗适应Rod-R及Max-R在b波潜伏期、振幅均存在显著差异;CNTF组与GFP组比较,暗适应Rod-R的b波潜伏期、振幅差异均无统计学意义（潜伏期t=-2.181,P>0.05;振幅t=1.598,P>0.05）,暗适应Max-R的b波潜伏期、振幅差异具有统计学意义（潜伏期t=-3.686,P<0.05;振幅t=8.095,P<0.05）。于注射后8W各组比较,暗适应Rod-R及暗适应Max-R的b波潜伏期及振幅GFP组较对照组及DMEM组无统计学差异（P>0.05）,CNTF组较对照组及DMEM组差异有统计学差异（P<0.05）。2.HE染色:细胞注射组各时间段均可见注射细胞分布于视网膜内界膜,部分细胞聚集于晶状体后极,可见少数细胞迁移至内丛状层。外核层细胞计数结果显示,注射后3D,CNTF组与GFP组较DMEM组及对照组视网膜外核层细胞数均有明显提高（P<0.05）,CNTF组与GFP组比较差异无统计学意义（P>0.05）;注射后1W及2W,CNTF组及GFP组与DMEM组及对照组亦存在差异,外核层细胞数明显提高（P<0.05）,CNTF组与GFP组比较亦存在统计学差异（P<0.05）;于注射后4W及8W,CNTF组与DMEM组及对照组亦存在差异（P<0.05）,而GFP组与DMEM组及对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。3.TUNEL染色:注射后2W,CNTF组与GFP组较DMEM组及对照组视网膜外核层细胞TUNEL阳性率均有显著减少,差异具有统计学意义（P<0.01）,CNTF组较GFP组比较视网膜外核层细胞TUNEL阳性率以明显减少,差异有统计学意义（P<0.01）;注射后8W,CNTF组较GFP组、DMEM组及对照组视网膜外核层细胞TUNEL阳性率均有减少,差异具有统计学意义（P<0.01）,GFP组较DMEM组及对照组比较视网膜外核层细胞TUNEL阳性率差异无统计学意义（P>0.05）。4.PCR结果:与正常组比较,玻璃体腔注射后2W,CNTF组、GFP组、DMEM组及对照组Caspase3表达量均有提高,差异具有统计学意义（P<0.05）;CNTF组及GFP组分别与DMEM组及对照组比较差异均具有统计学意义（P<0.05）;CNTF组与GFP组比较,具有统计学差异（t=-2.731,P<0.05）。5.移植细胞分布:石蜡切片示,于注射后2W,CNTF组及GFP组均可见GFP阳性细胞主要分布于视网膜内界膜前,部分细胞聚集于晶状体后极,视网膜内丛状层可见少许GFP阳性细胞。注射后8W,CNTF组仍可见少许GFP阳性细胞主要分布于视网膜内界膜前及内丛状层,而GFP组视网膜未见明显GFP阳性细胞。视网膜铺片结果显示:于注射后2W,CNTF组及GFP组视网膜可见较多GFP阳性细胞散在分布,CNTF组较GFP组GFP阳性细胞密度大。而注射后8W,CNTF组任可见少许GFP阳性细胞分布,而GFP组几乎未见明显GFP阳性细胞分布。结论:通过视网膜变性大鼠玻璃体腔注射CNTF基因修饰的骨髓间充质干细胞,其可在玻璃体腔持续存活,聚集于视网膜内界面前,部分可向视网膜内丛状层迁移,显著提高闪光视网膜电图水平,延缓视网膜感光细胞变性凋亡,降低凋亡相关蛋白Caspase3的表达水平,发挥对变性视网膜保护作用。