论文部分内容阅读
背景:结直肠癌是严重威胁人类健康的常见消化道恶性肿瘤,发病率和死亡率均较高。患者预后与肿瘤分期密切相关,因此寻找新的无创、简便而准确性强的结直肠癌标志物具有重要意义。循环miRNA稳定性高且检测方便,可作为多种疾病的诊断标志物。肿瘤细胞与肿瘤微环境是一个互相作用的整体,miRNA作为重要的转录后调控因子在其中发挥关键作用。肿瘤微环境具有缺氧、高浓度乳酸和营养物质缺乏等重要特征,不仅诱导Treg细胞、MDSC及TAM等免疫抑制性细胞的大量浸润,还可通过代谢重编程重塑浸润的免疫细胞,损伤其免疫监视与毒性功能,促使免疫逃逸的发生。肿瘤细胞来源miRNA可通过多种途径参与调控免疫抑制性微环境的形成。目的:筛选获得有效的结直肠癌诊断标志物并进行临床样本验证;在此基础上探究其与肿瘤微环境间的互相调控作用,尤其是对结直肠癌细胞和免疫抑制性微环境的影响。方法:利用miRNA测序筛选结直肠癌患者血清中表达上调的miRNA,通过靶基因预测与功能富集分析,探究其可能的生物学功能与分子机制;进一步利用TCGA数据库对差异表达miRNA进行组织表达水平分析,结合文献筛选得到候选miRNA并通过临床小样本验证其在结直肠癌血清中的表达水平。为评估miR-1290在结直肠癌中的诊断价值,通过RT-q PCR分别检测结直肠癌、胰腺癌、胃癌与健康对照的血清miR-1290水平,结合患者临床特征进行相关性分析。最后通过比较结直肠癌患者术前与术后的血清miR-1290表达水平差异,结合裸鼠皮下移植瘤模型,分析miR-1290在病情监测中的作用。为评估血清高表达miR-1290是否来源于肿瘤细胞,通过RT-q PCR检测miR-1290在结直肠癌组织、细胞系和细胞上清中的表达水平。为进一步探究miR-1290与肿瘤微环境间的互相调控作用,通过体外模拟肿瘤微环境,分析缺氧、葡萄糖剥夺、乳酸、ROS、TGF-β、IFN-γ及衰老等特征对肿瘤细胞miR-1290表达水平的影响;结合体外实验与皮下移植瘤模型探究miR-1290对结直肠癌进展的影响。为研究miR-1290在免疫抑制性微环境形成中的作用,通过检测细胞葡萄糖摄取、乳酸分泌及ATP产生水平,评估miR-1290在结直肠癌细胞代谢适应中的作用;利用TCGA来源数据进行免疫浸润分析,结合体外混合淋巴细胞反应与动物模型分析miR-1290表达水平对相关免疫细胞亚群功能和细胞因子分泌的影响。结果:1.结直肠癌患者血清差异表达miRNA的筛选与鉴定通过miRNA测序与差异表达分析,我们发现94个miRNA在结直肠癌血清中表达上调;根据表达倍数差异,筛选得到16个差异表达miRNA;靶基因预测与功能富集分析提示差异表达miRNA参与调控肿瘤生长;结合生物信息学分析与文献分析,我们选择miR-203a-3p,miR-194-5p,miR-146-5p,miR-1290和miR-96-5p等5个miRNA作为候选标志物;最后临床小样本验证发现仅miR-1290在结直肠癌血清中表达显著增高（P＜0.001）,miR-1290可能是潜在的结直肠癌标志物。2.血清miR-1290是一个结直肠癌诊断与病情监测标志物通过临床大样本检测与分析,我们发现血清miR-1290在结直肠癌（P＜0.05）、胰腺癌（P＜0.01）与胃癌（P＜0.01）中表达均显著增高。在结直肠癌的诊断中,AUC为0.7852（95%CI:0.6978-0.8726,P＜0.0001）,取截断值为11.79,灵敏度达42.00%,特异性达90.00%;与CEA联合可提高诊断效率。动物模型发现,裸鼠成瘤后血清miR-1290水平显著增高（P＜0.001）,化疗药物处理后肿瘤生长受到明显抑制,血清miR-1290水平随之下降（P＜0.001）;同时结直肠癌患者术后血清miR-1290表达水平较术前亦明显降低（P＜0.05）。3.miR-1290是一个受肿瘤微环境调控的促瘤分子miR-1290在结直肠癌组织中表达显著增高（P＜0.05）;结直肠癌细胞高表达miR-1290,且可将其分泌至细胞上清中。肿瘤微环境中缺氧、葡萄糖剥夺、ROS、TGF-β、IFN-γ、乳酸及化疗药物诱导衰老等因素可影响结直肠癌细胞中miR-1290表达。CCK-8检测与动物致瘤试验表明miR-1290可促进结直肠癌进展。4.miR-1290影响结直肠癌细胞能量代谢,参与诱导免疫抑制性微环境的形成miR-1290可促进结直肠癌细胞的葡萄糖摄取与ATP产生,影响乳酸分泌。免疫浸润分析发现miR-1290表达水平与Th2细胞浸润存在显著正相关（r=0.660,P＜0.001）,与CD56brightNK细胞浸润存在显著负相关（r=-0.480,P＜0.05）。miR-1290可促进CD8+T细胞中PD-1,TIGIT及TIM-3等耗竭相关分子表达,抑制IFN-γ分泌,参与诱导CD8+T细胞耗竭发生;miR-1290可诱导CD4+CD25+Treg细胞生成,发挥免疫抑制作用。结直肠癌细胞来源外泌体高度富集miR-1290,提示外泌体可能参与miR-1290介导的免疫抑制性微环境形成。结论:miR-1290在结直肠癌中高表达且其表达水平受肿瘤微环境相关因素调控,可促进结直肠癌进展,同时miR-1290参与调控结直肠癌细胞代谢重编程,并促进免疫抑制性微环境的形成,血清miR-1290在结直肠癌中具有诊断价值。