论文部分内容阅读
目的:在高脂饮食(high-fat diet,HFD)诱导的肥胖小鼠脂肪组织中,发现一群未成熟的、具有分泌促炎症性细胞因子的树突状细胞,并研究这种脂肪组织来源树突状细胞(adipose tissue dendritic cells,ATDCs)的表型及生物学功能。
方法:
1.采用FITC抗小鼠CD11c单克隆抗体(mAb)对HFD和正常饮食(normal diet,ND)小鼠脂肪组织来源的细胞进行染色;应用免疫磁珠法将HFD小鼠脂肪组织来源或脾脏来源的CD11c+细胞进行分选,电镜观察其形态,并采用PE-Cy5抗小鼠CD3和B220 mAb对细胞染色,通过流式细胞术(floW cytometry,FCM)进行分析。
2.利用免疫磁珠分选方法将HFD小鼠脂肪组织或脾脏组织来源的CD11c+细胞分选,同时分离ND小鼠腹腔巨噬细胞,将分离的三组细胞分别与表达红色荧光蛋白HcRed的大肠埃希菌(经3%多聚甲醛固定)37℃共培养2h,同时设立LPS刺激组,FCM分析各组细胞的吞噬能力。
3.应用FITC抗小鼠CD11c mAb及PE抗小鼠CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ mAb对HFD和ND小鼠脂肪组织细胞及脾脏组织细胞进行染色;FCM分析HFD小鼠脂肪组织来源或脾脏来源的CD11c+细胞的表型。
4.应用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PolymeraseChain Reaction,qRT-PCR)的方法检测HFD小鼠ATDCs及脾脏来源DC(SPDCs)的IL-6、TGF-β、IL-23p19、IL-12p40及IL-12p35等细胞因子mRNA的表达水平;酶联免疫吸附试验(Enzyme LinkedImmunosorbent Assay,ELISA)检测ATDCs和SPDCs培养上清中IL-6及IL-23的蛋白表达水平。
5.应用免疫磁珠分选方法将HFD和ND小鼠脂肪组织中的CD4+T细胞分离,将分离出的CD4+T细胞中加入离子霉素(ionomycin)和乙酸肉豆蔻佛波醇(phorbol myristate acetate,PMA)共培养4h,qRT-PCR检测IL-17及RORγt mRNA的表达水平。
6.应用免疫磁珠法分别分选6-8w正常小鼠脾脏来源的CD4+T细胞、HFD小鼠ATDCs或SPDCs,将1×106的CD4+T细胞和2×105的ATDCs或SPDCs共培养,同时设置抗小鼠IL-6 mAb组、抗小鼠IL-23 mAb组、抗小鼠IL-6 mAb+抗小鼠IL-23 mAb组及对照免疫球蛋白组;应用FITC抗小鼠CD4 mAb及PE抗小鼠IL-17 mAb对不同共培养体系中的细胞进行染色,FCM分析Th17细胞的比例,ELISA检测培养上清中IL-17的蛋白水平。
7.应用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)方法检测ATDCs中趋化因子受体CCR6、CCR5及CXCR2的表达,同时应用qRT-PCR的方法检测HFD及ND小鼠脂肪组织中相应趋化因子CCL20、MIP-1及IL-8的表达水平。
结果:
1.FCM检测发现,与ND小鼠相比,HFD小鼠脂肪组织中CD11c+细胞的比例明显增高;脂肪组织中CD11c+细胞具有很长的突触,富含线粒体并且胞质中极少看到溶酶体;同时脂肪组织来源的CD11c+细胞均不表达CD3及B220分子;吞噬实验结果显示脂肪组织来源的CD11c+细胞的吞噬能力强于CD11c+SPDCs,但又低于腹腔巨噬细胞;而脂肪组织来源的CD11c+细胞的F4/80分子的表达与CD11c+SPDCs相近,但低于腹腔巨噬细胞。上述结果提示HFD小鼠脂肪组织中存在着一群形态典型的CD11c+DCs;与ND小鼠相比较,HFD小鼠脂肪组织中浸润的CD11c+DCs细胞的比例明显增高。
2.FCM结果显示ATDCs的表面分子MHCⅠ及MHCⅡ,共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达均低于SPDCs;LPS刺激后,ATDCs的MHC分子或共刺激分子的表达均未有明显变化,并且ATDCs吞噬功也未发生改变,表明HFD小鼠脂肪组织的ATDCs是一群未成熟的、表型稳定的DC。
3.qRT-PCR检测显示,与SPDCs相比,ATDCs促炎症性细胞因子IL一6 mRNA(8.103±1.067vs111.5±24.39,p＜0.01)、TGF-β mRNA(15.44±1.641vs43.61±5.417,p＜0.01)、IL-23p19 mRNA(0.0143±0.009vs0.182±0.045,p＜0.01)、IL-12p40 mRNA(0.431±0.044 vs1.665±0.205,p＜0.01)、IL-12p35 mRNA(2.426±0.769vs0.225±0.074,p＜0.05)的表达水平明显增高;ELISA检测发现,ATDCs分泌细胞因子IL-6的能力明显高于SPDCs(276.0±76.11 pg/mlvs43.56±18.02pg/ml);同时ATDCs分泌细胞因子IL-23的能力也明显高于SPDCs(44.60±6.210 pg/mlvs7.835±0.9090 pg/ml),结果均具有统计学意义(p＜0.05)。上述结果提示ATDCs为一群具有高分泌促炎症性细胞因子能力的DC。
4.qRT-PCR结果显示,与ND小鼠相比,HFD小鼠脂肪组织中CD4+T细胞IL-17 mRNA(8.960±1.581vs26.82±2.216,p＜0.01)及特异性转录因子RORγt mRNA(1.682±0.8117vs6.757±1.988,p＜0.05)的表达水平明显增高。
5.Th17细胞体外培养分化体系中,SPDCs和ATDCs诱导Th17细胞分化的比例分别为2.557±0.2554%vs4.697±0.257%(p＜0.01);ELISA检测培养上清中IL-17水平,SPDCs培养孔为0.244±0.048pg/ml,ATDCs培养孔为0.456±0.522 pg/ml(p＜0.05),加入anti-IL-6mAb的培养孔为0.241±0.047,加入anti-IL-23 mAb的培养孔为0.215±0.028,结果提示Th17细胞的分化与ATDCs分泌的细胞因子IL-6和IL-23有关。
6.RT-PCR结果显示ATDCs有趋化因子受体CCR6、CCR5及CXCR2的表达。qRT-PCR结果显示,与ND小鼠相比,HFD小鼠脂肪组织中趋化因子CCL20(0.544±0.228vs4.777±1.379 p＜0.05)的表达明显增高,而其他的趋化因子MIP-1(0.814±0.228128vs4.777±1.379p=0.0166)和IL-8(10.40±2.677vs8.403±4.297 p=0.7137)的变化不明显。
结论:
1.与ND组小鼠相比,HFD诱导的肥胖小鼠脂肪组织中存在一群未成熟的、表型稳定的树突状细胞。
2.ATDCs具有较强的分泌促炎症性细胞因子IL-6、IL-23的能力,体外研究发现ATDCs可以促进CD4+T细胞向Th17细胞的分化,这种分化与ATDCs分泌IL-6和IL-23有关。
3.ATDCs上有趋化因子受体CCR6、CCR5及CXCR2的表达;同时与ND小鼠相比,HFD小鼠脂肪组织中趋化因子CCL20的表达明显增高,提示这种受体-配体的相互作用可能趋化ATDCs至HFD小鼠脂肪组织。