【摘 要】
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凤眼果广泛分布在热带和亚热带地区,其种子口感软糯,营养丰富,是食品工业的重要原料。但凤眼果壳作为凤眼果的工业副产物尚未得到开发利用,造成了极大的资源浪费。随着全球糖尿病患者人数逐年增加,糖尿病成为人类健康的重要威胁,而目前常用的降糖药物存在各种副作用。因此,利用天然果蔬中的功能活性因子辅助调节血糖成为了一种更加安全的选择。本文以凤眼果壳为研究对象,使用两种不同极性的溶剂二次萃取得到凤眼果壳乙酸乙酯
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凤眼果广泛分布在热带和亚热带地区,其种子口感软糯,营养丰富,是食品工业的重要原料。但凤眼果壳作为凤眼果的工业副产物尚未得到开发利用,造成了极大的资源浪费。随着全球糖尿病患者人数逐年增加,糖尿病成为人类健康的重要威胁,而目前常用的降糖药物存在各种副作用。因此,利用天然果蔬中的功能活性因子辅助调节血糖成为了一种更加安全的选择。本文以凤眼果壳为研究对象,使用两种不同极性的溶剂二次萃取得到凤眼果壳乙酸乙酯相（EAF）,然后利用LC-ESI-MS/MS-MRM技术鉴定EAF的组成,之后考察EAF对两种淀粉消化酶（α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶）的抑制活性,并结合动力学方程、荧光光谱、圆二色谱和分子对接等方法阐明其抑制机制,最后运用Caco-2单层细胞模型,研究EAF对肠道葡萄糖转运和吸收的影响,进一步从基因角度分析其降血糖的机制。主要研究内容和实验结果如下:（1）采用75%丙酮辅助超声波提取和乙酸乙酯二次萃取的方式制备EAF,测定其总酚和总黄酮含量,并利用LC-ESI-MS/MS-MRM技术进行定性定量分析。结果表明,EAF中总酚含量为156.22±3.74 mg GAE/g DW,总黄酮含量为154.75±8.19 mg QE/g DW。LC-ESI-MS/MS-MRM技术鉴定了二氢槲皮素、儿茶素、阿魏酸、金丝桃苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、异槲皮苷、丹酚酸B、杨梅苷、表儿茶素没食子酸酯、咖啡酸、香草酸、香草醛、矢车菊素-3-O-芸香糖苷、木犀草素、肉桂酸和大波斯菊苷16种酚类化合物。通过分析MRM模式下的碎片离子发现,黄酮类化合物C环稳定性最差易脱去小分子碎片和发生断裂;酚酸类化合物易脱去CO、CH3、CO2和CH3OH等中性分子;O-糖苷键和酯键是优先断裂的化学键。（2）通过体外酶活抑制模型、动力学方程、荧光淬灭光谱、同步荧光光谱、圆二色谱和分子对接,研究EAF对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制效果和抑制机制。结果表明,EAF对α-葡萄糖苷酶(IC50值为69.390±1.410μg/m L)的抑制活性强于α-淀粉酶(IC50值为2.151±0.044 mg/m L),且抑制方式均为可逆、反竞争性抑制。荧光淬灭光谱表明,EAF对α-葡萄糖苷酶的淬灭方式为动态淬灭,对α-淀粉酶为静态淬灭,且温度越低,结合常数越大,EAF对两种酶的亲和力也越强。EAF在α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶上都仅存在单一的结合位点,范得华力和氢键为主要作用力。同步荧光光谱表明EAF可以改变α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶中酪氨酸和色氨酸残基的微环境。圆二色谱表明EAF可以明显改变α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的二级结构。分子对接显示,7种主要成分中,表儿茶素没食子酸酯、金丝桃苷、杨梅苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷可直接与α-葡萄糖苷酶上的活性氨基酸残基结合;木犀草素-7-O-葡萄糖苷和表儿茶素没食子酸酯可直接与α-淀粉酶上的活性氨基酸残基结合,表明以上化合物可通过与底物竞争活性位点而抑制酶活。（3）运用Caco-2单层细胞模型模拟葡萄糖穿过肠上皮细胞的过程,研究EAF对葡萄糖载体蛋白活性（SGLT1和GLUT2）的影响,同时利用RT-q PCR技术分析相关基因的表达情况。结果表明,细胞跨膜电阻值大于400Ω·cm~2,碱性磷酸酶活性比（AP/BL）大于10,透射电镜显示连接紧密的细胞层和清晰的微绒毛结构。以上结果表明Caco-2单层细胞模型建立成功。EAF对GLUT2介导的葡萄糖转运的抑制效果更好,抑制率为54%。在抑制葡萄糖吸收实验中,有Na+的抑制率（80%）大于无Na+（62%）。并且对葡萄糖吸收的抑制率大于葡萄糖转运。RT-q PCR表明,EAF可能通过抑制PLC/PKC信号通路和关键基因PKA的表达调控血糖水平。
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