南美白对虾是最重要的水产养殖产品之一,具有重要的社会经济价值和营养价值。与此同时,南美白对虾也是各种腐败和致病微生物生长繁殖的最佳场所。由微生物活动引起的水产品腐败变质问题,对食品安全和公众健康安全提出了严重挑战。因此,我们需要开发有效、安全的杀菌技术以及建立准确、高效的微生物检测和分析技术,从而满足日益增长的需求新鲜、安全、优质水产品的要求。酸性电解水(AEW)杀菌技术是近年来发展的一种新型非热杀菌技术。由于其可现场生产、原材料价格低廉、安全环保且高效、快速和广谱杀菌,因此已经被广泛的应用在农、畜牧业,医药行业和食品工业中设备的杀菌消毒过程中。但是目前由于现代分子生物学技术不能区分死活菌,导致我们不能有效的检验其杀菌效果,因此急需发展活菌多样性分析技术来解决这一问题。基于叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)的分子生物学技术是目前有效的活菌分析技术。PMA是一种核酸染料,能渗透进入具有不完整细胞膜的细胞中,在可见光的暴露下与DNA进行交联反应,使膜破损细胞的DNA无法在后续的PCR反应中进行扩增,从而在细菌检测中屏蔽死菌,实现活菌检测。因此,本文以南美白对虾为研究对象(1)利用PMA结合PCR-DGGE技术和高通量测序技术构建一种活菌多样性分析技术;(2)活菌多样性分析技术应用于评价不同浓度AEW对南美白对虾的杀菌效果;(3)利用活菌多样性分析技术解析AEW处理后南美白对虾在贮藏过程中的微生物多样性变化。本课题主要研究内容和研究结果如下:1.构建活菌多样性分析技术:PMA结合PCR-DGGE技术分析了PMA对采收后的生鲜南美白对虾在4℃和25℃贮藏条件下微生物多样性的影响,建立一种可以反映活的微生物多样性变化的分析技术。结果表明在25℃贮藏条件下PMA处理并没有显著改变微生物群落组成。在4℃条件下贮藏超过1 d后,PMA处理的样品和非PMA处理的样品之间微生物群落的香浓多样性指数()值存在显著性差异。通过PCoA分析,不同温度条件下贮藏的样品依然各自聚集在一起,但是PMA处理样品和非PMA处理样品之间存在差异。在4℃贮藏条件下PMA处理样品和非PMA处理样品之间距离较远,说明微生物群落组成存在明显差异。Vibrio cholerae(霍乱弧菌)、Exiguobacterium acetylicum(乙酰短杆菌)、Aeromonas enteropelogenes(肠棕气单胞菌)、Eubacterium multiforme(多形真杆菌)和Vibrio mimicus(拟态弧菌)这些菌的条带在PMA处理样品中消失。随后用高通量测序技术对4℃贮藏条件下的分析结果进行验证,结果显示同一样本在经过PMA处理之后值都要低于非PMA处理样本,而且Lactococcus(乳球菌属)、Exiguobacterium(微杆菌属)、Kurthia(库特氏菌属)和Enterococcus(肠球菌属)在PMA处理后的样品中相对含量均明显降低,与PCR-DGGE分析结果一致。总之,本研究构建的PMA结合PCR-DGGE和高通量测序技术可作为一个有效的分析活菌多样性的工具。2.活菌多样性分析技术应用于评价不同浓度AEW对南美白对虾的杀菌效果。将采收后的生鲜南美白对虾分别在灭菌的自来水(TW)和不同浓度的AEW(0.05%NaCl,0.15%NaCl,0.30%NaCl)分别处理2 min和5 min。结果显示AEW处理后图谱中的条带数量整体上要少于TW处理的菌群条带数,且DGGE图谱条带亮度随AEW浓度的增加而明显降低。基于DGGE图谱的UPGMA聚类分析表明当较高浓度AEW(0.15%NaCl和0.30%NaCl)处理时,PMA处理样品和非PMA处理样品之间距离较远,相似度低,说明样品在经过PMA处理之后微生物群落多样性变化较大,此结论与通过高通量测序分析得出的PCoA结论一致。此外,通过PMA处理结合DGGE图谱分析和高通量测序分析得出浓度为0.15%NaCl的AEW处理5 min时杀菌效果最佳,并且此处理条件下PMA处理的样品中微生物的H′值和S值比TW处理的样品分别降低了44%和66%,比非PMA处理样品分别降低了37%和38%。以上结果表明活菌多样性分析技术可以准确反映出AEW杀菌后南美白对虾中微生物多样性变化、明确不同浓度AEW处理后的杀菌效果。3.利用活菌多样性分析技术解析AEW处理后南美白对虾在贮藏过程中的微生物多样性变化。结果显示基于DGGE图谱和高通量测序的H′值在PMA处理样品中均比未经过PMA处理的样品明显降低。通过高通量测序热图可知11种菌属在PMA处理后的样品中,在热图中代表的颜色菌由红色或白色转变成浅白色或蓝色,说明PMA处理降低了这些菌属的含量。另外,在贮藏天数相同时,DGGE图谱中AEW处理样品中条带亮度普遍低于TW处理样品,并且AEW处理样品中通过DGGE条带计算获得的H′值以及通过高通量测序获得的H′值都低于TW处理样品。根据高通量测序柱形图和热图分析,在贮藏至第14 d时,AEW处理组样品中的Firmicutes(厚壁菌门)和Bacteroidetes(拟杆菌门)明显低于TW处理组。此外,虽然在贮藏末期TW处理组和AEW处理组样品中的Fusobacteria(梭杆菌门)都消失,但是Fusobacteria(梭杆菌门)在AEW处理组贮藏第4 d之后就已经消失,然而在TW处理组直至贮藏第14 d才消失。有趣的是Psychrobacter(嗜冷杆菌属)在TW处理样品中随着时间增加呈现增长趋势,但是在AEW处理后的贮藏样品中却随着贮藏时间的延长而降低。本研究所运用的活菌多样性分析技术为监测AEW处理后南美白对虾贮藏过程中真实的微生物群落变化趋势提供了良好的技术支持。综上所述,本课题的研究为活菌检测技术的应用供技术支撑和理论依据,能够促进活菌多样性分析、真实的微生物群落监测及AEW杀菌效果的评价等其相关研究的发展,进而达到保障食品质量安全和改善公共卫生状况的目的。