目的:肺癌是新发病例数位居第二,患者预后差,全球死亡率最高的恶性肿瘤。大多数患者在发现初期就发生了转移,失去了手术根治的机会。在药物治疗方面,从最初的传统放化疗发展到靶向治疗,内科治疗得到了里程碑式的进展。但是在为患者带来临床获益的同时随之而来的是不可避免的耐药性的问题。尽管免疫治疗的发展也取得了可观的进展,但是在存在EGFR突变的患者中免疫治疗几乎没有获益,非小细胞肺癌患者的预后仍然较差,晚期肺癌的患者生活质量更是难以保证。因此,探索新的耐药机制,寻找新的治疗靶点以及下一代治疗药物克服内科治疗的耐药性迫在眉睫。一代和二代EGFR-TKI自诞生以来为存在EGFR敏感突变的非小细胞肺癌患者带来了最大限度的临床获益,随着耐药问题的日渐突出,三代EGFR-TKI也被指南列为了一线推荐,因为肺癌的异质性直接或间接地导致了耐药机制的多样性,主要针对T790M突变的三代TKI奥西替尼的疗效因人而异。有许多研究者开始了四代EGFR-TKI的探索,但是目前仍然停留在体内和体外实验阶段,尚没有进入临床研究。大多研究与三代TKI相似,主要针对EGFR依赖的位点突变来进行药物设计,在真实世界中,这种顾此失彼的案例不计其数。所以在克服EGFR-TKI耐药性的药物探索中需要更多元和全面的药物发现策略。在本研究中,为了寻找可能逆转EGFR-TKI获得性耐药的潜在药物,我们基于芯片数据富集差异基因,利用药物重定位基于重要的差异基因集进行药物筛选,再利用既往建立的EGFR-TKI耐药细胞系验证药物逆转耐药的作用,以及基于生物信息学分析和分子生物学实验探索和验证其可能的作用机制。为筛选出能用于逆转EGFR-TKI耐药的潜在药物提供理论依据。研究方法:1、使用Bioconductor的R包对EGFR-TKI耐药芯片数据集GSE69181的样本进行标准化,探针转化后差异分析,并筛选出差异倍数大于2的差异基因集合。2、将差异基因按照上调和下调分为两个列表,通过CMap相应的窗口上传列表数据后进行药物重定位分析,待结果匹配完成后查看匹配分数小于-0.95同时匹配的P值小于0.05的药物。3、用MTT法对既往建立冻存的两株耐药细胞系进行IC50的重新鉴定;验证GRB2对耐药细胞增殖活力的影响及检测赖甲环素的药物毒性作用以及其对埃克替尼IC50的影响。4、用蛋白免疫印迹法对耐药细胞的表型标记物进行检测;检测相关的细胞周期蛋白和凋亡相关蛋白;验证亲本细胞和耐药细胞中检测GRB2的表达以及检测在各个不同处理的样本中EGFR-AKT/ERK/STAT3信号通路的活化蛋白及本底蛋白的表达。5、用集落实验检测赖甲环素和埃克替尼各自及联合使用对两株耐药细胞增殖的抑制作用并比较其差异。6、用EdU实验检测赖甲环素和埃克替尼各自及联合使用对两株耐药细胞增殖活力及DNA复制的抑制作用并比较其差异以及检测干扰GRB2、赖甲环素处理及联合处理对耐药细胞DNA复制的影响。7、用流式细胞术分别检测在赖甲环素和埃克替尼各自及联合作用下对两株耐药细胞的细胞周期和细胞凋亡的促进作用并分析比较各组差异以及分别检测干扰GRB2、赖甲环素处理及联合处理下对两株耐药细胞的细胞周期和细胞凋亡的促进作用并分析比较各组差异。8、建立裸鼠皮下成瘤模型在体内验证赖甲环素对埃克替尼的敏感性。9、为了进一步探索赖甲环素逆转EGFR-TKI耐药的机制,我们用网络药理学的方法基于药物结构等构建了药物的作用靶点,也用PPI网络筛选了EGFR-TKI耐药的致病基因,综合两个网络分析得到了赖甲环素针对EGFR-TKI耐药性的作用靶点。10、用GSEA富集分析方法分析GRB2的生物学功能。11、用si RNA及慢病毒质粒对耐药细胞中的GRB2进行干扰后用实时定量PCR实验及蛋白免疫印迹实验进行敲减效率验证。12、用NOD/SCID小鼠建立双侧皮下成瘤模型,体内验证赖甲环素对GRB2的靶向抑制作用。结果:1、CMap药物重定位发现赖甲环素可能逆转埃克替尼耐药细胞的耐药性。首先我们用R软件包处理GEO在线数据,然后进行差异基因分析得到EGFR-TKI耐药的差异基因,进一步用这24个上调和40个下调的差异基因在CMap数据库中进行匹配重新定位药物得到以赖甲环素为最优匹配的药物。2、EGFR-TKI耐药的非小细胞肺癌细胞株的鉴定。接着我们完成了对耐药细胞系的表型及IC50重新鉴定,证明了细胞系的耐药性及其EMT的特征后用于赖甲环素的抗肿瘤作用验证。3、赖甲环素逆转NSCLC细胞获得性埃克替尼耐药。我们发现赖甲环素本身具有一定的抗肿瘤作用,我们通过联合使用赖甲环素和埃克替尼检测耐药细胞的增殖活力,结果显示赖甲环素可以以浓度依赖的方式增敏埃克替尼的抗肿瘤作用,我们最终筛选了10μM的赖甲环素浓度作为后续研究的浓度,能在自身抗肿瘤作用不显著的条件下最大程度地增敏埃克替尼的抗肿瘤作用。后续的研究发现该浓度下的赖甲环素可以显著降低埃克替尼的IC50。除此之外,集落实验也证实了赖甲环素可以恢复埃克替尼的抗肿瘤作用,而进一步的EdU实验证实赖甲环素可以促进埃克替尼抑制肿瘤细胞DNA复制的作用。4、赖甲环素通过阻滞细胞周期促进EGFR-TKI耐药的非小细胞肺癌细胞凋亡。流式细胞术检测的细胞周期和细胞凋亡的结果可以看出,赖甲环素通过阻滞G2/M期促进了细胞凋亡,进而逆转了埃克替尼的耐药。5、赖甲环素在体内促进埃克替尼对耐药细胞增殖的抑制作用。我们通过建立裸鼠皮下成瘤模型,在体内验证了埃克替尼和赖甲环素在耐药肿瘤中的抗肿瘤作用,在埃克替尼与赖甲环素联合使用时对耐药肿瘤组织的抑制增殖作用更为显著。6、赖甲环素靶向GRB2逆转非小细胞肺癌的EGFR-TKI耐药。在体内外明确了赖甲环素可以逆转埃克替尼的耐药后我们进一步对赖甲环素的作用靶点进行了探索。首先我们综合使用靶点预测网站BATMAN-TCM和Swiss Target Pridiction对赖甲环素进行基于应用研究和化学结构的靶点预测,将预测的靶点构建蛋白-蛋白网络以寻找重要蛋白群,我们通过Degree值来筛选和确认网络中的核心蛋白,由此得到药物靶点蛋白。同时,我们也利用在GEO芯片中分析得到的24个显著上调的疾病相关蛋白,即是耐药致病蛋白做蛋白-蛋白网络或作,通过同样的方法得到核心的重要疾病蛋白。对两个网络的蛋白取交集得到赖甲环素针对EGFR-TKI耐药细胞的59个作用靶点。通过对这些靶点的KEGG富集分析我们发现其主要富集于多个肿瘤通路和细胞周期和凋亡相关的通路,我们将富集程度最高的前3个通路取交集得到GRB2和MAPK1两个核心靶点。进一步用分子对接的方法分析赖甲环素与靶蛋白的结合自由能可以得到GRB2更能与赖甲环素稳定结合。7、GRB2促进EGFR-TKI耐药细胞增殖。蛋白免疫印迹实验证明了GRB2在耐药细胞中较亲本细胞高表达,同时在GSEA富集分析中也得到了GRB2与G2/M检查点等细胞周期相关的通路正相关。si RNA和慢病毒质粒的敲减效率均可达80%以上。我们进一步的MTT实验证实了用si RNA敲减GRB2之后,两株耐药细胞的增殖活力被显著抑制。8、赖甲环素通过靶向GRB2逆转EGFR-TKI耐药。EdU实验证明赖甲环素和敲减GRB2处理均可以显著抑制耐药细胞的DNA复制,敲减GRB2的同时用赖甲环素处理对DNA复制的抑制作用显著增强。9、赖甲环素靶向GRB2促进耐药细胞的周期阻滞诱导细胞凋亡。为了进一步验证敲减GRB2对细胞周期和细胞凋亡的影响,我们用流式细胞术检测了敲减GRB2和赖甲环素处理的细胞周期和细胞凋亡。从细胞周期结果可以看出,敲减GRB2后耐药细胞发生了明显的G2/M期阻滞,赖甲环素处理后耐药细胞也发生了G2/M期阻滞;在敲减GRB2的同时用赖甲环素处理G2/M期阻滞显著上调。从细胞凋亡结果可以看出敲减GRB2后耐药细胞发生了明显的细胞凋亡,赖甲环素处理后耐药细胞也发生了细胞凋亡,在敲减GRB2的同时用赖甲环素处理后细胞凋亡程度被显著上调。所以,赖甲环素靶向GRB3阻滞了细胞耐药周期促进了耐药细胞凋亡,进而逆转了埃克替尼的耐药。10、赖甲环素抑制EGFR-TKI耐药细胞的EGFR-AKT/ERK/STAT3通路的活化。蛋白免疫印迹结果表明单独使用赖甲环素治疗后,GRB2明显下调;单独使用埃克替尼后无明显变化,但是在联合埃克替尼治疗后下调更为显著。在两株耐药细胞中单独使用埃克替尼后EGFR-AKT/ERK/STAT3通路的活化没有受到影响,而单独使用赖甲环素治疗后EGFR/AKT/ERK通路的活化较DMSO处理的对照组有所减少;此外,赖甲环素联合埃克替尼可显著下调HCC827R5和PC9R10细胞中p-EGFR的表达,并显著下调p-m TOR、p-AKT、p-ERK和p-STAT3。11、赖甲环素靶向GRB2抑制EGFR-TKI耐药细胞的EGFR-AKT/ERK/STAT3通路的活化。我们用蛋白免疫印迹实验对GRB2的表达进行分析,从结果中可以看出在单独敲减GRB2之后,GRB2明显下调;在si-GRB2联合埃克替尼治疗后,GRB2的下调程度更为显著。在两株耐药细胞中单独使用赖甲环素处理后p-EGFR,p-m TOR,p-AKT,p-ERK及p-STAT3的表达下调,然而EGFR,m TOR,AKT,ERK,STAT3的表达没有变化,而单独使用赖甲环素治疗后p-EGFR,p-m TOR,p-AKT,p-ERK及p-STAT3的表达较si-NC处理的对照组显著减少;此外,在同时使用si-GRB2和赖甲环素处理的HGC827R5和PC9R10细胞中,p-EGFR,p-AKT,p-ERK及p-STAT3的下调程度更为显著。12、赖甲环素靶向GRB2抑制小鼠EGFR-TKI耐药肿瘤的EGFR-AKT/ERK通路的活化。我们将小鼠的瘤体组织进行免疫组化染色分析。一方面的结果提示GRB2的组织水平表达在赖甲环素作用后明显下调,联合埃克替尼作用后更为显著,而埃克替尼对GRB2的表达没有明显的调控;另一方面的结果显示单独使用埃克替尼对p-EGFR,p-AKT,p-ERK的表达并没有明显的下调作用,单独使用赖甲环素对p-EGFR,p-AKT,p-ERK的表达有轻度的抑制作用,但是当联合使用埃克替尼和赖甲环素时,p-EGFR,p-AKT,p-ERK在小鼠耐药肿瘤组织内被显著地下调。除此之外,在赖甲环素和Sh-GRB2单独作用的实验组中,p-EGFR、p-AKT和p-ERK均有显著降低,且在赖甲环素和Sh-GRB2联合处理后抑制作用显著增强。结论:1、CMap药物重定位赖甲环素可能逆转EGFR-TKI耐药。2、赖甲环素促进埃克替尼的抗肿瘤增殖作用。3、赖甲环素促进埃克替尼阻滞耐药细胞的G2/M期诱导细胞凋亡。4、GRB2促进埃克替尼耐药的NSCLC细胞的增殖。5、赖甲环素通过靶向GRB2抑制EGFR-TKI耐药的NSCLC细胞增殖。6、赖甲环素靶向GRB2促进EGFR-TKI耐药细胞G2/M期阻滞并诱导细胞凋亡。7、赖甲环素促进埃克替尼对EGFR-AKT/ERK/STAT3信号通路活化。8、赖甲环素靶向GRB2抑制EGFR-AKT/ERK/STAT3信号通路活化。