论文部分内容阅读
猪链球菌(Streptococcus suis)是引起猪链球菌病的主要病原体,是上呼吸道的条件致病菌,一旦猪发病可引起多种疾病,如脑膜炎,败血症,关节炎,心内膜炎,甚至导致死亡,给世界养猪业带来巨大的经济损失。在33个血清型中,猪链球菌2型(Streptococcus suis 2,S.suis 2)被认为是养猪行业中是最流行的,也是毒力最强的病原菌,而且S.suis 2还是一种严重的人兽共患病原体,可致人脑膜炎和毒素休克综合征。毒素抗毒素系统(toxin-antitoxin system,TAS)是细菌基因组中广泛存在的一类小型遗传元件,最初发现于低拷贝质粒上,用于维持质粒的稳定性,基因组中的TAS改变了细菌的生理框架,使其提高对外界环境的适应能力,促使细菌成为优势菌。本课题通过对预测的7对Type II TAS进行初步的鉴定筛选,探究缺失TAS突变株在毒力方面的影响,取得的主要结果如下:1.RT-PCR验证毒素抗毒素基因共转录提取S.suis 2(SC19菌株)的总RNA,反转录得到cDNA,然后以cDNA为模板,用特异性引物进行PCR扩增,验证毒素抗毒素基因共转录情况,证明毒素抗毒素是由同一操纵子调控转录的。2.毒素和抗毒素功能特性的探究构建成功的重组质粒p BADHis A-toxin(p BADHis A-T)转化至Top10感受态细胞,加入阿拉伯糖诱导毒素表达,绘制生长曲线同时进行活菌计数。结果表明诱导毒素表达时,含有p BADHis A-T1,p BADHis A-T5,p BADHis A-T7,p BADHis A-T9的菌株生长受到明显抑制,诱导毒素表达2h后,其中含有p BADHis A-T1,p BADHis A-T7,p BADHis A-T9的细菌生长趋势已经基本不变,而含有p BADHis A-T5的细菌生长变慢;活菌计数结果表明诱导毒素蛋白1(T1),毒素蛋白7(T7),毒素蛋白9(T9)表达,对细菌有明显的杀菌作用,但细菌并没有被全部杀死,4h后仍然存活的细菌开始缓慢恢复生长,而诱导表达毒素蛋白5(T5)对细菌没有明显的杀菌作用。为进一步确定并验证猪链球菌中存在的毒素抗毒素系统,我们将构建成功的重组质粒p ET30a-antitoxin,和p BADHis A-toxin一起共转化至BL21感受态细胞,加入IPTG和阿拉伯糖,分别诱导抗毒素和毒素表达,绘制细菌的生长曲线,观察抗毒素能否中和毒素,同时对诱导5h后的细菌革兰氏染色,观察细菌在诱导毒素抗毒素蛋白表达情况下的形态。结果表明抗毒素蛋白1(A1),抗毒素蛋白7(A7),抗毒素蛋白9(A9)能够中和相应的毒素蛋白,使细菌生长恢复正常,而只诱导T1,T7,T9表达的细菌,生长明显受到限制,而只诱导T5表达的细菌,生长则恢复到正常水平,说明第5对不是毒素抗毒素系统。革兰氏染色结果表明毒素抗毒素的诱导表达可使E.coli形态发生改变,形成明显的丝状,可能是细菌的一种保护机制。3.毒素抗毒素系统缺失突变株、互补菌株的构建及鉴定根据上述实验结果,对第1对,第7对,第9对毒素抗毒素系统构建相对应的基因缺失突变株。运用温敏性质粒p SET4s构建重组质粒,电转化至SC19感受态细胞,运用温度和壮观霉素抗性筛选得到得到单交换菌株,通过第二次同源重组筛选到基因缺失突变株缺失突变株。运用p SET2构建互补质粒,电转化至相应的毒素抗毒素系统缺失突变株中,以抗性筛选得到互补菌株,最后通过PCR扩增和DNA测序的方法,证明毒素抗毒素系统缺失突变株和互补菌株构建成功。4.毒素抗毒素系统缺失突变株对S.suis 2的影响用SC19和缺失突变株感染小鼠,绘制存活曲线,结果表明突变株对S.suis 2毒力基本不显著。使用红霉素处理野生株和突变株,尝试激活毒素抗毒素系统,对菌株生长曲线进行测定,同时进行活菌计数,结果表明野生株和突变株有一定的差异,但结果不显著。