论文部分内容阅读
研究背景大肠癌(colorectal carcinoma, CRC)是发病率居世界第三的常见恶性肿瘤。中国每年新增大肠癌患者40万,死亡率为7.35/10万。手术及放化疗是CRC的传统治疗手段,虽然能抑制肿瘤生长,但疗效有限,导致临床疗效出现瓶颈。血管生成是CRC生长、侵袭、转移的关键因素之一,而血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是CRC血管生成中的关键因子,和患者的不良预后相关。标准化疗方案中加入抗VEGF药物,如贝伐单抗,可明显改善转移性CRC患者的预后,但效果有限。除VEGF外,还有一些未知的促CRC血管生成因子有待探索,这些因子的发现及鉴定将为新的抗血管生成方案的制定奠定基础。炎症是恶性肿瘤的七大特征之一,与肿瘤的发生发展密切相关。研究发现,肿瘤微环境中的促炎症因子,如白介素6(Interleukin 6,IL-6)、IL-1β,肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和IL- 8可诱发炎症,趋化炎症细胞(如T细胞和肿瘤浸润性巨噬细胞等)分泌细胞因子刺激肿瘤增殖,诱导免疫耐受,并分泌VEGF等促血管生成因子参与肿瘤血管生成。IL-17是一种新发现的促炎症细胞因子,主要由活化的CD4~+ T辅助细胞,即Th17细胞产生,巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞和CD8~+ T细胞也可少量分泌。IL-17阳性细胞在炎症相关性肿瘤,如胃癌、肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)、非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)、前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌中均高表达。在移植瘤模型中,转染了IL-17的肿瘤生长变快,而且血管生成增加。目前,关于CRC中IL-17的细胞来源、IL-17与CRC临床病理特征的相关性、IL-17在CRC发生发展中的作用仍有待进一步研究。由于IL-17可促进多种靶细胞分泌IL-6、IL-8和VEGF等细胞因子,同时人肺腺癌细胞株,骨肉瘤细胞株均表达IL-17受体(IL-17 receptor,IL-17R),故我们推测CRC细胞也表达IL-17R,而IL-17可以通过促进CRC细胞分泌VEGF等促血管生成因子,并作用于血管内皮,进而促进肿瘤血管生成。目的明确IL-17对CRC预后和血管生成的影响,探讨IL-17促进血管生成的可能分子机制,为寻找抗肿瘤血管生成靶点提供新的依据。方法1.通过免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜下观察IL-17与CD4(T辅助细胞表面标志)、IL-17与CD68(巨噬细胞表面标志)的共表达,以鉴定IL-17的细胞来源。2.免疫组织化学法检测IL-17蛋白在52例III期CRC组织中的表达,并分析IL-17表达与肿瘤临床病理特征、预后的关系。Kaplan-Meier法(log-rank检验)分析IL-17阳性、阴性表达组中生存率的差异,单因素和多因素COX风险回归模型分析多个因素对患者预后的影响。3.免疫组织化学法检测52例CRC组织中CD31的表达,t检验分析MVD与IL-17表达的关系。4.流式细胞术、RT-PCR检测SW480, HCT116, HT-29, LoVo和LS174T等5种CRC细胞株中IL-17R的表达,并进一步以表达IL-17R的LoVo细胞株为主要体外模型,PCR-array筛选IL-17刺激LoVo后表达上调的促血管生成相关因子。5.定量RT-PCR和ELISA法检测IL-17刺激4种CRC细胞株后VEGF的表达改变。免疫组织化学法检测VEGF在52例CRC组织中的表达,卡方检验分析CRC组织中IL-17与VEGF之间的相关性,t检验分析CRC组织中MVD与VEGF表达的关系。结果1.激光共聚焦显微镜观察CD4、CD68与IL-17免疫荧光染色,发现CD4与IL-17、CD68与IL-17共表达于肿瘤间质,表明大肠癌中IL-17来源于CD4~+T淋巴细胞和巨噬细胞。2.52例III期CRC组织切片进行免疫组化染色,发现有26例高表达IL-17。大部分的IL-17阳性细胞表现出典型的T细胞和巨噬细胞形态特征。IL-17在远癌正常组织,腺瘤,癌旁和癌内组织均表达,但以癌旁,特别是癌内最为明显。分析IL-17与临床病理特征的关系,我们发现:IL-17表达与年龄、性别、肿瘤部位、分化程度和病理类型无关。K-M法分析发现,IL-17表达与患者不良预后相关,IL-17阴性表达患者5年生存率为72.41%,而IL-17阳性表达患者为38.08%,两者有统计学差异( p = 0.002),IL-17阳性表达患者有相对较短的总生存期(overall survival,OS)。单因素和多因素分析显示,肿瘤内的IL-17的表达为OS的独立预后因子。3.免疫组化检测52例CRC石蜡切片内CD31与IL-17表达的关系,发现IL-17阳性表达患者的MVD(91.54±30.48)高于IL-17阴性表达患者(66.35±32.82)(P=0.006)。4.LoVo、LS174T、HCT-116、SW480、HT-29均表达IL-17R,PCR芯片筛选IL- 17刺激LoVo后表达上调的促血管生成因子,发现外源性IL-17可显著上调VEGF ,尿激酶纤溶酶原活化因子(plasminogen activator urokinase,PLAU),神经纤毛蛋白(neuropilin 2,NRP2),金属基质蛋白酶9( matrix metallopeptidase 9,MMP9),IL-6和DNA结合抑制因子3(inhibitor of DNA binding 3,ID3)等促血管生成相关因子的表达。5.LoVo、LS174T、HCT-116、HT-29经用不同浓度的IL-17作用6 h后, VEGF mRNA表达呈剂量依赖性增加,在IL-17浓度为10,50,100 ng/ml时与对照组之间的差异均有统计学意义,在IL-17浓度为100ng/ml时达到峰值,为对照组的4.20±0.71、2.90±0.47、3.82±0.43、3.65±0.62倍(P <0.01)。以上细胞用100 ng /ml的IL-17作用48 h,ELISA检测VEGF蛋白表达量与对照组之间的差异有统计学意义(1009.3±45.5 vs 401.6±37.4, 900.5±23.4 vs 298.1±14.3, 712.2±25.4 vs 365.3±30.5, 575.8±62.7 vs 260.5±23.2, P <0.01)。免疫组化检测52例CRC石蜡切片内IL-17与VEGF表达的关系,MVD与VEGF表达的关系,发现IL-17表达与VEGF的表达具有相关性( P <0.01)。VEGF阳性表达患者的MVD(86.74±33.24)高于VEGF阴性表达患者(67.43±32.09)( P <0.05)。结论1.人CRC组织中,IL-17主要来源于肿瘤间质的CD4~+ T细胞和巨噬细胞,IL-17在人CRC组织内高表达,与不良预后显著相关,是独立的预后预测因子。2.人CRC组织中,IL-17表达与MVD相关,提示IL-17可能通过促进肿瘤的血管生成而发挥促肿瘤效应。3.IL-17R表达于多种人CRC细胞系,体外实验证实IL-17可以上调LoVo细胞株VEGF,PLAU,NRP2,MMP9,IL-6和ID3等促血管生成相关因子的表达。4.IL-17在人CRC组织中的表达与VEGF相关,IL- 17可以上调CRC细胞株VEGF的表达,IL-17可能通过促进CRC细胞分泌VEGF而促进肿瘤的血管生成。