玉米丝黑穗病菌SSR分子标记开发及其应用研究

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玉米丝黑穂病对我国各地玉米区产量造成十分严重的危害,并且降低了玉米的品质,因此一度将其列为我国的三大玉米病害之一。该病害由孢堆黑粉菌(Sporisorium reilianum)引起,是一种对玉米产生造成极大危害的土传真菌病害,对玉米生产造成严重的影响。本研究^人NCBI数据库中下载了全部23条玉米丝黑穗病菌的全基因组序列,从中选取前3条(1、2、3)染色体基因组序列,分析SSR组成与分布特征,在此基础上设计合成15对SSR引物,以孢堆黑粉菌为研究对象,筛选出10对多态性丰富的SSR引物,对山西省12个不同地区的117个菌种进行遗传多样性分析,并利用一对多态性引物CAG(4)对苗期病株的带菌情况进行检测。其主要结果如下:利用SSR Hunter软件对下载的3条玉米丝黑穗病菌的全基因组序列进行搜索,对碱基重复在2-6个核苷酸之间的SSR序列进行分析。分析结果表明,在该基因组中共发现888条符合条件的微卫星序列,占三条全基因组碱基总数的0.068%。其中重复序列数量最多的为三核苷酸,达到329个,四、五、六核苷酸重复序列数量分别为101个、155个、185个。孢堆黑粉菌基因组的SSR序列,三核苷酸重复序列重复的次数最多,为23次;其次为二核苷酸,17次;此外,在所有SSR序列中长度最长的是三核苷酸重复序列,其长度为69bp。在二核苷酸重复中,CT类SSR序列重复最多达到33个,GCAT类重复最少,只有一个。利用引物设计软件primer premier5.0对符合搜索条件的SSR序列进行引物设计,共设计出15对引物。经检测,全部能够在孢堆黑粉菌中有效扩增,有效扩增率为100%,其中10对引物具有多态性。说明基于孢堆黑粉菌微卫星序列设计的引物具有较高的多态性频率。将此多态性良好的10对引物对供试的117株玉米丝黑穗病菌进行SSR-PCR扩增,共扩增出45条谱带,其中多态性标记位点为31个,多态性位点的比例为68.8%。扩增产物大多分布于100~500bp之间。遗传多样分析结果表明,遗传相似系数范围为0.54-0.98,平均为0.79。说明各菌株间存在明显的遗传多样性。从聚类结果可以看出,在遗传相似系数(GS)为0.782时,供试的117个孢堆黑粉菌菌株可以明显的划分为6个SSR类群。多数地理来源相同的菌株聚为同一类群,总体来看,孢堆黑粉菌的遗传分化很明显。在田间病圃186个品种(系)中,随机选取16个品种(系),随机选取每个品种(系)七叶期植株6-10株为研究对象,利用筛选出的多态性良好的一对引物CAG(4),进行苗期带菌率情况检测。从结果可以看出,16种不同品种(系)的幼苗室内检出率与田间发病率总趋势基本一致。
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