论文部分内容阅读
背景心房颤动（房颤）是临床上常见的心律失常之一，其发病率随年龄增长而增加。房颤与多种基础心脏疾病相关如，冠状动脉粥样硬化心脏病（冠心病）、高血压、心脏瓣膜病、心力衰竭（心衰）以及心脏手术等，且尚有相当一部分房颤患者无可检测到的心脏基础疾病。房颤引发血流动力学障碍和血栓栓塞事件，致使其发病率高、死亡率高、经济花费巨大。目前，房颤的发病机制尚未完全明确，其临床治疗效果也不满意。房颤的药物治疗方法主要是针对诱发房颤的基质，心房纤维化是一个重要的房颤基质，其与反复房颤事件后心房结构进行性退化有关。心房纤维化的具体分子机制目前仍不清楚，目前研究发现，转化生长因子β（TGF-β）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）、Janus激酶(JAK)/信号转导子和转录激活子(STAT）通路、结缔组织生长因子（CTGF）、氧化的（Ca2+）/钙调蛋白依赖蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）等参与心房纤维化的形成。肾素血管紧张素系统与多种心血管疾病的发病机制相关，心脏局部RAS系统的激活作为一个始动因子在心房纤维化中发挥重要作用。RAS激活后，通过其主要活性成分AngⅡ刺激大量信号途径激活，引起心房纤维化，目前已证实的致心脏结构重构的确切信号通路有， AngⅡ/Rac1/STAT3、 AngⅡ/Rac1/CTGF/Cx43（N-Cadherin）、Ang/Cn/NFAT/MMPs、 AngⅡ/MAPKs/TGF-beta1/TRAF6、肥大细胞/PDGF-A轴等。本课题前期研究已发现，房颤病人和胸主动脉部分结扎的大鼠模型的心房组织中，心房纤维化加重，AngⅡ的浓度升高，并且伴随着PDGF、Rac1、NF-κB表达增加。而后在分别运用厄贝沙坦和/或辛伐他汀干预后发现，心房纤维化程度的降低，AngII浓度降低，并伴随PDGF、活性Rac1及NF-κB的表达量减少。提示AngII、PDGF、Rac1及NF-κB均参与心房纤维化机制的形成，厄贝沙坦和辛伐他汀可有效抑制心房纤维化的形成。目的从体外培养细胞水平上，进一步探讨AngII、PDGF、Rac1以及NF-κB是否有相互作用，以及其之间的上下游关系。方法分离培养原代SD鼠心房成纤维细胞，用慢病毒载体转染wild-typePDGF（WT-PDGF）, constitutively active PDGF (PDGF-C)，dominant－negative PDGF(PDGF-D)， Constitutively active Rac1(RacV12)和dominant－negative Rac1(RacN17)，并用AngⅡ、辛伐他汀、厄贝沙坦、Rac1特异性阻滞剂NSC23766干预心房成纤维细胞，用免疫印迹测定NF-κB的蛋白表达量，PAK-PBD Pull down测定活性Rac1的表达，ELISA测定细胞内的PDGF蛋白的含量，实时定量PCR测定纤维化标记物COL1A1mRNA水平表达，以及PDGF与Rac1的转染率。结果1.在心房成纤维细胞中，AngⅡ（10-6mol/L）不同时间刺激心房成纤维细胞后，细胞内PDGF的浓度在AngⅡ干预5min时增加（p＜0.05），活性Rac1的表达在30min时显著升高（p＜0.01）、NF-κB蛋白表达量在2h时明显增加（p＜0.01）。AngⅡ以不同浓度干预心房成纤维细胞后24h后,细胞内PDGF的浓度在AngⅡ浓度为10-8mol/L时显著升高（p＜0.01），活性Rac1的表达以及NF-κB蛋白表达量在AngⅡ浓度为10-7mol/L时均增加（p＜0.05）。2.在心房成纤维细胞内，高表达PDGF后，活性Rac1与NF-κB蛋白表达量均升高（均p＜0.01）。沉默PDGF后，活性Rac1与NF-κB蛋白表达量均降低（均p＜0.01）。3.在心房成纤维细胞内，高表达Rac1后，NF-κB蛋白表达量升高（p＜0.01），沉默Rac1后，NF-κB蛋白表达量降低（p＜0.01）。4.分别用辛伐他汀和厄贝沙坦干预心房成纤维细胞后， Rac1蛋白的活性与NF-κB蛋白的表达均降低（均p＜0.01），且二者联合干预时，降低的程度更大。5.Rac1特异性抑制剂NSC23766干预心房成纤维细胞后，NF-κB蛋白的表达量降低（p＜0.01）。结论本研究，从体外培养细胞水平，揭示AngⅡ通过PDGF/Rac1/NF-κB信号通路促进心房纤维化的形成，RAS抑制剂和他汀类药物可阻断这一信号通路，逆转AngⅡ介导的心房纤维化。同时提示PDGF可能是促进心房纤维化的重要因子，并且是防治房颤的新靶点之一。