中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）是我国重要的海水养殖品种,具有适应能力强、生长速度快、耐低温、营养丰富等优点。养殖环境恶化、管理不当等因素引起的环境胁迫所诱导的应激反应,不仅对中国对虾的生理状态及抗病力有显著的影响,甚至严重影响了对虾的养殖成活率。良好的水环境是对虾养殖成败的关键,pH、氨氮是衡量养殖水质质量的重要指标,本文通过研究pH、氨氮胁迫对中国对虾细胞凋亡和抗氧化系统影响,揭示了中国对虾应对pH、氨氮胁迫的应激机理,为对虾抗逆选育和健康养殖提供技术支撑。研究内容包括以下四个部分:第一部分,中国对虾细胞凋亡因子Caspase基因cDNA克隆和表达分析。从中国对虾肝胰腺中克隆了Caspase基因,该基因cDNA全长1329b（pGenBank注册号为GU597089）,其中开放式阅读框为972bp,包含109bp的5′非编码区（5′-UTR）,248bp的3′非编码区（3′-UTR）及一个多腺苷酸信号AATAAA。该基因编码323个氨基酸,预测分子量为36.0kDa,pI为6.27。Caspase编码的氨基酸包含Caspase家族保守的活性位点中心（QACRG五肽）和两个结构域（大亚基p20和小亚基p10）,推导的氨基酸不存在信号肽序列。中国对虾Caspase蛋白包含特殊的氨基酸残基His150和Cys198,这两个氨基酸对于催化Caspase酶活性起到至关重要的作用。多序列分析结果表明F. chinensis Caspase与Penaeus monodon Caspase、Fenneropenaeus merguiensis Caspase、Litopenaeus vannamei Caspase-3蛋白质序列同源性分别为83%、82%、76%。应用荧光定量PCR方法分析了中国对虾暴露于pH7.0和pH9.0水环境中,各组织Caspase基因表达的水平。结果显示:pH7.0组中国对虾血淋巴细胞Caspase基因表达水平12h显著升高,48h达最低,96h达最高值,148h显著低于对照组（P<0.05）;pH9.0组中国对虾血淋巴细胞Caspase基因表达水平3h显著升高,24h显著低于对照组（P<0.05）,120h达最大值并显著高于对照组。pH7.0组中国对虾鳃Caspase基因表达水平在48h和120h低于对照组,其余各时间点表达水平均高于对照组,且在148h达最高值;pH9.0组中国对虾鳃Caspase表达水平3h显著低于对照组（P<0.05）,之后逐渐增加,24h达最高值,48h后随着胁迫时间的延长Caspase基因表达水平逐渐降低。pH7.0组中国对虾肝胰腺Caspase基因表达水平均低于对照组,但3h、48h和96h例外;pH9.0组中国对虾肝胰腺Caspase基因表达水平3h显著增加,之后表达水平逐渐增加,120h达最高值,且在24h至148h期间均显著高于对照组（P<0.05）。高、低pH胁迫对中国对虾肌肉Caspase基因表达变化相似,3h略有升高,96h达最高值,148h均显著低于对照组（P<0.05）。高、低pH胁迫中国对虾3h后,其淋巴器官Caspase基因表达水平增加,且随着胁迫时间延长,各组Caspase基因表达水平一直处于较高水平。pH7.0组中国对虾胃Caspase基因表达3-12h显著低于对照组（P<0.05）,之后呈波浪式变化,148h达最高值,与对照组相比差异显著（P<0.05）;pH9.0组中国对虾胃Caspase基因表达3h显著降低,12-72h表达水平逐渐升高,120h达最高值。TUNEL分析结果表明中国对虾暴露于pH7.0和pH9.0的水环境中12h,肝胰腺组织开始出现细胞凋亡现象,并且随着胁迫时间的延长肝胰腺细胞凋亡现象越明显,与TUNEL分析中的阳性对照表现相一致。相反pH8.2（对照组）中国对虾肝胰腺没有发现被深染的细胞核,与TUNEL阴性对照组的表现一致。这说明高、低pH胁迫均能够诱导中国对虾肝胰腺组织的细胞凋亡。第二部分,中国对虾Caspase基因的重组表达、分离纯化和多克隆抗体的制备。克隆中国对虾Caspase基因开放式阅读框序列,构建了该基因原核表达载体pET30a-CAS,通过E. coli稀有密码子分析,将该重组质粒转化入大肠杆菌BL21 （DE） pLysS,成功实现了Caspase基因在E. Coli中的表达。SDS-PAGE分析显示该重组蛋白分子大小约为50 kDa,略大于软件预测的分子量。MALDI-TOF-MS分析验证了该蛋白是中国对虾Caspase蛋白。利用固定金属亲和层析和Co-NTA技术获得的纯化Caspase重组蛋白,免疫新西兰大白兔制备了特异性多克隆抗体,Western blot结果表明中国对虾血淋巴细胞、鳃、肌肉、淋巴器官、心脏、胃和肝胰腺组织中均有Caspase蛋白的表达,但在血清中未检测到特异性的谱带。第三部分,pH胁迫对中国对虾抗氧化系统及HSP90基因表达的影响。将中国对虾暴露于pH8.2（对照组）、7.0、9.0（胁迫组）的水体中148 h,于胁迫后0、3、12、24、48、72、96、120、148h测定鳃、肝胰腺、肌肉和血淋巴总抗氧化活力（T-AOC）、抗超氧阴离子活力、过氧化氢酶（CAT）活力和CAT、过氧化物还原酶（Prx）和HSP90基因表达的情况。结果显示, pH胁迫12h-24h,对虾各组织T-AOC、抗超氧阴离子、CAT酶活力及CAT基因表达均增加,pH胁迫120h-148h上述指标受到抑制。对虾肝胰腺和肌肉Prx基因表达随胁迫时间增加逐渐升高,鳃和血淋巴Prx基因表达随胁迫时间增加呈下降趋势。高pH（9.0）胁迫时,对虾鳃抗氧化系统酶活力及基因表达水平达峰时间较其他3个组织明显缩短;而低pH（7.0）胁迫时,对虾肝胰腺抗氧化系统酶活力比其他组织变化快。高pH（9.0）组中国对虾肝胰腺HSP90基因表达显著高于对照组（P<0.05）,肌肉组织HSP90基因表达除72h外均显著低于对照组（P<0.05）。试验结果表明,pH胁迫3h-24h对中国对虾抗氧化系统酶活力及相关基因表达有一定的诱导效果,但胁迫120h-148h则抑制其抗氧化系统功能,可能会导致中国对虾机体的氧化损伤;中国对虾鳃和肝胰腺分别对高、低pH胁迫较敏感。第四部分,氨氮胁迫对中国对虾抗氧化系统、血淋巴氨氮成分及HSP90基因表达的影响。将中国对虾暴露于不同氨氮浓度（0mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L）的水体中96h,于胁迫后0、6、24、48、72、96h测定中国对虾血淋巴氨氮、尿素氮浓度和鳃、肝胰腺、肌肉和血淋巴的T-AOC、抗超氧阴离子、Na⁺ K⁺-ATPase、Ca²⁺ Mg²⁺-ATPase活性及CAT、Prx、Caspase、HSP90基因表达水平,结果显示:（1）当水体氨氮浓度从0.220mg/L到13.449mg/L时,中国对虾血淋巴氨氮浓度明显升高,于24h-28h达最低值,72-96h达最高值,但均显著高于对照组（P<0.05）。（2）当水体氨氮浓度从0.220mg/L到9.446mg/L时:中国对虾血淋巴尿素氮含量明显升高且显著高于对照组（P<0.05）,各组尿素氮浓度6h达最高值;中国对虾鳃、肝胰腺和肌肉Na⁺ K⁺-ATPase、Ca²⁺ Mg²⁺-ATPase活性及HSP90基因表达水平明显升高,并且各指标变化基本一致。当水体氨氮浓度从9.446mg/L到13.449mg/L时,血淋巴尿素氮浓度和鳃、肝胰腺、肌肉Na⁺ K⁺-ATPase、Ca²⁺ Mg²⁺-ATPase活性及HSP90基因表达水平明显降低,说明高氨氮浓度抑制血淋巴尿素氮的合成、ATPase活性及HSP90基因表达水平（3）当水体氨氮浓度从0.303mg/L到8.625mg/L时,中国对虾T-AOC、抗超氧阴离子活力及CAT基因表达水平升高,并在胁迫后6h或96h达最高值;Prx基因表达水平均在72-96h达最高值。当水体氨氮浓度大于8.625mg/L时中国对虾的抗氧化系统受到抑制。（4）Caspase基因表达水平均在氨氮胁迫后的72-96h达最高值（实验后期）,该表达变化与pH胁迫后Caspase基因的表达变化相似。推测高浓度氨氮能够诱导中国对虾Caspase基因的表达,进而诱导中国对虾的细胞凋亡。