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研究目的:目前临床上被应用治疗白血病的药物有很多种,但绝大多数药物在治疗白血病的过程中,会给患者带来严重的副反应和耐药性,久而久之,对患者造成了严重的心理负担,治疗效果不尽人意。有研究表明,某些来源于生物体内的天然短肽具有抗菌,杀伤肿瘤细胞活性作用。本研究根据天然日本刺沙蚕体内丝氨酸蛋白酶活性肽氨基酸序列测定和数据库对比分析结果,合成分子量只有12Kb的短肽,通过研究合成肽对K562细胞、Nalm-6细胞的杀伤作用情况,探讨其对白血病细胞作用的可能机制,为治疗白血病,降低化疗药物的毒副反应、及其耐药性提供新思路。方法:1.合成日本刺沙蚕活性肽（NJP9-A）的体外抑菌活性检测。2.将NJP9-A分别处理体外培养的239T细胞和HUVEC细胞,用CCK-8法检测细胞增殖状态;NJP9-A作用于人正常红细胞检测对红细胞溶血影响。3.通过体外培养K562细胞、Nalm-6细胞,利用台盼蓝染料可进入死细胞膜原理检测细胞活力;CCK-8法检测细胞增殖状态;利用普通光学显微镜和荧光显微镜观察NJP9-A作用后细胞形态学改变;检测荧光标记的NJP9-A对细胞的结合作用;利用流式细胞术检测细胞凋亡百分比。4.利用NOD/SCID小鼠尾静脉注射Nalm-6细胞造急性淋巴细胞白血病动物模型,观察小鼠生活状态、体重变化、外周血白细胞计数、外周血细胞变化等基础体征,检测NJP9-A对白血病模型小鼠可能的干预效果。5.利用凋亡抗体芯片,检测分析凋亡相关的蛋白差异表达,采用Fold-change（表达差异倍数）对差异表达蛋白（Differential expression proteins,DEPs）进行筛选,设置筛选条件如下:Fold Change=<0.83或者Fold Change>=1.2及荧光信号>150。基于Gene ontology（GO）database对DEPs进行GO功能注释分析;基于Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）对DEPs进行Pathway富集分析。6.通过Western blot实验验证差异蛋白及其相关蛋白表达,探讨NJP9-A对白血病细胞作用的可能机制。结果:1.NJP9-A对金黄色葡萄球菌有明显抑制作用;对正常人外周血溶血效率低,其半数溶血浓度HC50为≥500μM。2.NJP9-A低浓度时对白血病细胞K562、Nalm-6细胞有抑制生长作用,但浓度高低与抑制效果没有明显的线性关系;对239T细胞和HUVEC细胞生长抑制作用不明显。3.NJP9-A处理的白血病细胞,在光学显微镜下可明显观察到细胞出现凋亡、坏死等形态学改变;荧光显微镜下可观察到NJP9-A与细胞膜某些部位先结合,进而进入细胞质中发挥作用;流式细胞术检测到细胞凋亡。4.初步观察白血病模型组与白血病模型治疗组小鼠,提示NJP9-A干预有部分缓解作用。5.凋亡抗体芯片分析显示,NJP9-A处理K562细胞后CD40L、cIAP-2、IGFBP-1、IGFBP-2、sTNF-R2、TNF-alpha、XIAP蛋白表达上调,其它检测的蛋白表达大多下调。其中bad、BIM、caspase8、IGF-1、IGF-2、sTNF-R1蛋白与空白对照组相比表达下调的Fold Change>1.5。6.Westen blot检测结果显示IGFBP1和IGFBP2表达增强,Caspase3（32KD）和Caspase8（55KD）的表达减弱,与凋亡抗体芯片检测的结果相一致;而Active Caspase3、Caspase3（p12）、Caspase8（p10）、Caspase8（p18）与对照组相比表达明显增加;随着时间的延长PIK3R1表达下调,而p-ERK1+ERK2表达上调。结论:结果表明NJP9-A对对金黄色葡萄球菌有明显抑制作用;NJP9-A对人外周血红溶血效率不明显,其半数溶血浓度HC50为≥500μM;较低浓度NJP9-A可以抑制白血病细胞K562、Nalm-6细胞增殖,促进其凋亡;NJP9-A可能先作用于细胞膜后,又进入细胞内通过调节一些蛋白的表达,如上调IGFBP-1、IGFBP-2、下调IGF-1、IGF-2等蛋白表达,激活Caspase家族,影响PI3K/AKT、ERK1/2等途径促进白血病细胞的凋亡和坏死;NJP9-A对NOD/SCID小鼠白血病有部分缓解作用。