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目的: 研究携带IL-18基因的条件增殖型腺病毒ZD55-IL-18在人恶性黑色素瘤A375细胞中的表达情况及对A375细胞荷瘤鼠的生长抑制作用并初步探讨其机制，为进一步研究IL-18的抗肿瘤机制和临床应用ZD55-IL-18靶向治疗恶性黑色素瘤奠定实验基础。
方法:
1.体外实验
1.1 体外培养人恶性黑色素瘤A375细胞株，ZD55-IL-18、ZD55-EGFP与Ad-IL-18感染A375细胞。
1.2 荧光显微镜、结晶紫染色法观察ZD55-IL-18对A375的细胞病作用。
1.3 通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测IL-18基因mRNA的表达。
1.4 Western blot检测腺病毒ElA、IL-18蛋白的表达情况。
1.5 TNUEL法检测ZD55-IL-18诱导A375细胞的凋亡情况。
1.6 MTT法检测ZD55-IL-18对A375细胞的生长抑制作用。
2.体内实验
2.1 体外培养人恶性黑色素瘤A375细胞株，建立裸鼠人恶性黑色素瘤移植瘤模型。
2.2 移植瘤瘤体内分别注射病毒ZD55-IL-18、Ad-IL-18、ZD55-EGFP及PBS，病毒每次注射7×108PFU，连续注射三天。
2.3 期测量肿瘤体积并于接种44 d后切除肿瘤组织称重观察肿瘤生长抑制情况。
2.4 切取肿瘤进行HE染色观察肿瘤细胞生长形态。
2.5 免疫组织化学法检测肿瘤组织E1A、IL-18、CD34、VEGF蛋白表达。
2.6 激光共聚焦显微镜检测移植瘤组织E1A及IL-18蛋白表达。
2.7 TUNEL法检测移植瘤组织凋亡情况。
2.8 取裸鼠肝脏、肺脏行病理学检测观察移植瘤转移情况。
结果:
1.体外实验
1.1 细胞毒性实验结果：ZD55-IL-18、ZD55-EGFP与Ad-IL-18感染A375细胞5天后，对A375细胞均有杀伤作用。MOI=1时，ZD55-IL-18可以将A375细胞全部杀灭，而ZD55-EGFP、Ad-IL-18的杀伤作用较弱，达到相同杀伤效应ZD55-EGFP、Ad-IL-18的MOI值分别为10、100。
1.2 ZD55-EGFP增加外源基因在A375细胞内的表达感染1d后，ZD55-EGFP和Ad-EGFP感染的A375细胞中都只有很弱的荧光蛋白表达。但3天后，ZD55-EGFP感染的A375细胞中大多细胞出现了明显的细胞病变且荧光蛋白表达量显著增加，明显高于Ad-EGFP感染的细胞
1.3 RT-PCR结果表明：ZD55-IL-18、ZD55-EGFP与Ad-IL-18感染A375细胞48h后，IL-18mRNA表达分别是对照组的(479.08±8.92)％、(211.79±6.24)％、(372.73±7.56)％，各组间有统计学意义(P<0.05)。
1.4 Western blot显示：病毒ZD55-IL-18、ZD55-EGFP与Ad-IL-18感染A375细胞48h后，IL-18蛋白表达分别是对照组的(1619.36±17.92)％、(422.08±6.38)％、(1139.52±15.27)％，各组间有统计学意义(P<0.05)。ZD55-IL-18处理组、ZD55-EGFP处理组可以检测到E1A的表达，Ad-IL-18处理组没有E1A的表达，表明ZD55-IL-18可在肿瘤细胞内增殖。
1.5 TUNEL凋亡：ZD55-IL-18、ZD55-EGFP与Ad-IL-18、对照组各组凋亡细胞阳性率分别为(62.73±2.93)％、(50.66±1.79)％、(22.54±3.26)％、(12.23±2.83)％。各组之间差异有统计学意义(P<0.05)。ZD55-IL-18与其它各组相比差异有统计学意义(P<0.05)。
1.6 MTT法检测结果说明：ZD55-IL-18可以明显抑制A375细胞增殖：(1) 用MOI=10的ZD55-IL-18、、ZD55-EGFP与Ad-IL-18感染A375细胞，4d后存活率分别为(37.6±1.31)％、(44.7±1.52)％、(66.7±1.53)％，各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。(2) 感染4d后，MOI=0.1、1、10、100时ZD55-IL-18处理组细胞存活率分别为(76.9±1.15)％、(55.6±2.82)％、(37.6±1.31)％、(16.5±1.11)％，各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。
2 体内实验
2.1 成功建立裸鼠人恶性黑色素移植瘤模型。
2.2 瘤内注射不同病毒44 d后ZD55-IL-18组肿瘤体积为(1039.378±29.67)mm3，ZD55-EGFP组肿瘤体积为(1839.22±52.88)mm3，Ad-IL-18组为(2900.46±62.65)mm3，PBS组为(3980.24±63.78)mm3，各组间有显著性差异(P<0.05)；接种44 d后ZD55-IL-18组、ZD55-EGFP组、Ad-IL-18组和PBS组最终平均瘤重分别为(1.149±0.503)g、(2.98±1.151)g、(4.55±1.046)g、(6.422±0.934)g，各组之间差异有统计学意义(P<0.05)。
2.3 E1A蛋白免疫组化检测实验结果显示：在PBS处理组与Ad-IL-18处理组无E1A蛋白的表达，而ZD55-IL-18、ZD55-EGFP处理组有大量E1A蛋白的表达；IL-18蛋白表达强弱依次为ZD55-IL-18处理组(90.25±3.75)％>Ad-IL-18处理组(73.37±1.87)％>ZD55-EGFP处理组(35.27±2.74)％>PBS处理组(18.27±2.85)％，各组之间差异有统计学意义(P<0.05)；CD34蛋白免疫组化检测实验结果显示PBS处理组(87.78±2.54)％>Ad-IL-18处理组(58.73±2.23)％>ZD55-EGFP处理组(25.43±1.35)％>ZD55-IL-18处理组(15.54±3.52)％，各组之间差异有统计学意义(P<0.05)：VEGF蛋白的表达量PBS处理组(84.67±1.64)％>Ad-IL-18处理组(60.34±2.78)％>ZD55-EGFP处理组(23.27±1.87)％>ZD55-IL-18处理组(14.26±2.49)％，各组之间差异有统计学意义(P<0.05)。
2.4 激光共聚焦显微镜下观察显示，E1A蛋白在ZD55-IL-18处理组及ZD55-EGFP处理组示荧光阳性，说明有E1A蛋白表达，显示病毒复制，而Ad-IL-18和PBS处理组示荧光阴性。IL-18蛋白荧光强弱依次为：ZD55-IL-18处理组>Ad-IL-18处理组>ZD55-EGFP处理组>PBS处理组。
2.5 凋亡检测结果显示：不同处理组移植瘤细胞凋亡阳性率依次为：ZD55-IL-18处理组平均为(86.28±3.25)％；ZD55-EGFP处理组平均为(64.43±4.34)％；Ad-IL-18处理组平均为(43.67±3.46)％；PBS处理组平均为(10.73±2.48)％。各组之间差异有统计学意义(P<0.05)。
2.6 各处理组肝脏及肺脏HE染色切片显示肝脏均正常，未示有移植瘤远处转移。PBS组肺脏全部发生肿瘤转移，转移百分率为100％，Ad-IL18组肺脏转移两只，ZD55-IL18处理组及ZD55-EGFP处理组未发生肿瘤肺转移。
结论: ZD55-IL-18可在A375细胞中体内外增殖且高效表达IL-18基因并能诱导A375细胞的凋亡、抑制恶性黑色素瘤细胞生长。另外，ZD55-IL-18可以抑制裸鼠人恶性黑色素瘤移植瘤的血管生成和恶性黑色素瘤的远处转移，显示出良好的治疗效果。