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糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病最常见的慢性并发症之一,慢性高血糖导致的代谢紊乱被认为是导致糖尿病并发症发生的最主要因素。近年的研究发现,慢性高血糖导致的氧化应激在糖尿病慢性并发症中发挥重要作用。动物实验表明高血糖导致视网膜代谢异常,包括多元醇通路、非酶糖化、氧化应激、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等的异常,引起微血管病变。统一发病机制提出氧化应激引起机体生成活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)增加,导致各种组织损伤,激活相关细胞内信号转导系统,如caspase-3和NF-kB,诱导细胞凋亡;线粒体内膜的损伤增加了电子漏出,产生更多的ROS,导致线粒体能量代谢障碍, ATP合成减少,影响细胞的整体功能。ROS可诱导NF-kB的过表达,促进微血管细胞的凋亡,使微血管通透性增加,基底膜增厚;同时VEGF表达增强可促进新生血管的形成,加重视网膜微血管病变。糖尿病微血管病变主要表现在视网膜、肾脏等组织。视网膜病变主要病理变化为毛细血管周细胞减少,基底膜增厚,毛细血管腔狭窄,新生血管形成;视细胞膜盘结构紊乱,甚至断裂、溶解;线粒体等细胞器肿胀变性;细胞核固缩,染色质聚集等变化。体内、体外实验均证实抗氧化治疗可有效的减轻ROS对组织的损伤。络病是多种原因引起许多疾病发展到一定阶段产生的病理状态,包括络脉淤阻、络脉急拙、络虚不荣,不同于血淤症的全新的领域。络病还涵盖了血管内皮功能障碍、动脉粥样硬化、血管痉挛等血管滋生的变化。通络方剂(Tongluo Recipe,TLR)是根据中医络病理论研制而成的复方制剂,由人参、水蛭、全蝎、蜈蚣、土鳖虫、赤芍等药物组成。药理研究表明,人参具有降血脂、血糖的功能,延缓糖尿病的发生,提高胰岛神经丛胆碱酯酶活性;水蛭能够利尿、减少尿蛋白排出;土鳖虫、全蝎抗凝、抗血栓形成的作用可改善微循环;赤芍具有降低全血黏度、抑制血小板聚集,降低纤维蛋白原等作用。全方具有扩张血管、抗凝、降低血黏度、改善微循环的作用。已有研究证实通络方剂可通过清除自由基,改善神经滋养血管的血液流变性,发挥对糖尿病周围神经病变的治疗作用;保护糖尿病肾脏功能。通络方药未发现有明显的降血糖、升高体质量的作用,对糖尿病周围神经病变、肾脏的保护作用并不依赖于其调节血糖水平的效应。褪黑素(Melatonin,Mel)是强效自由基清除剂,可直接中和羟自由基和过氧化自由基,还可提高过氧化物酶活性起间接抗氧化作用。褪黑素是目前已知唯一有给电子能力的抗氧化剂,通过向亲电子中间体和部分还原的缺电子生物大分子提供电子发挥抗氧化效应,而且其特殊的结构形式又提高了抗氧化的能力。本研究拟观察比较通络方剂、褪黑素在DR中的抗氧化、对视网膜血管细胞凋亡的保护作用。研究共分为三个部分:第一部分,糖尿病造模成功后给予通络方剂干预,观察通络方剂对糖尿病大鼠视网膜病变过氧化物产生和ATP合成的作用;第二部分,观察通络方剂对糖尿病大鼠视网膜病变细胞凋亡的作用;第三部分,观察通络方剂对糖尿病大鼠视网膜病变组织结构变化的作用。第一部分通络方剂对DR大鼠氧化应激及视网膜ATP代谢的作用目的:研究通络方剂对DR大鼠氧化应激及视网膜ATP代谢的作用。方法:链脲佐菌素(60mg/kg)诱导糖尿病大鼠模型,造模成功后继续饲养12周以建立DR大鼠模型,随后按体重和血糖随机分为5组:糖尿病对照组、通络方剂小剂量组(0.5g.kg-1.d-1)、通络方剂大剂量组(2.0g.kg-1.d-1)、褪黑素小剂量组(0.5mg.kg-1.d-1)、褪黑素大剂量组(10mg.kg-1.d-1)。糖尿病造模前预设鼠龄和体重相当的正常对照组(NC)7只。分组后即开始干预,持续12周后测定各组大鼠血糖和体重,胰岛素,血脂,PAI-1,血浆和视网膜内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)、ATP/ADP/AMP含量。结果:与正常对照组大鼠比较,各组糖尿病大鼠血糖显著升高而体重增长较低(P<0.01)。治疗组较糖尿病组高密度脂蛋白(HDL)略升高,低密度脂蛋白(LDL)降低;胰岛素差异不显著;PAI-1降低,差异显著(P<0.05),尤以大剂量明显(P<0.01)。糖尿病对照组大鼠血浆和视网膜中MDA含量明显增加,SOD、GSH-Px活性显著降低(P<0.05)。正常组ATP明显高于糖尿病各组,差异极显著(P<0.01);而ADP/AMP糖尿病各组明显高于正常组(P<0.01);各治疗组ATP含量高于糖尿病组(P<0.05)。结论:通络方剂对血糖无明显作用,体质量有一定增加。可显著提高糖尿病大鼠血浆和视网膜内SOD、GSH-Px活性、降低丙二醛含量(P<0.05);对PAI-1等血流变指标亦有改善作用。通络方剂可显著提高糖尿病大鼠视网膜ATP的合成,与褪黑素无显著差别。糖尿病时自由基的损伤和机体抗氧化能力的降低可能在DR的发生发展中发挥重要作用。糖尿病大鼠视网膜能量代谢障碍,可能与自由基的损伤和机体抗氧化能力的降低、微循环障碍有关。已明确褪黑素为强抗氧化剂,推测通络方剂同样具有明显的抗氧化作用,而且可能通过降低PAI-1的生成,改善血液动力学、流变学,减轻视网膜缺血、缺氧,维持线粒体合成ATP的功能,减少过氧化物的产生。第二部分通络方剂对糖尿病视网膜病变大鼠血管细胞凋亡的作用目的:应用免疫组化方法研究通络方剂对DR大鼠血管细胞凋亡因子NF-kB、VEGF的表达的影响。应用RT-PCR方法检测NF-kB、VEGF mRNA的表达。方法:链脲佐菌素(60mg/kg)诱导糖尿病大鼠模型,造模成功后继续饲养12周以建立DR大鼠模型,随后按体重和血糖随机分为5组:糖尿病对照组、通络方剂小剂量组(0.5g.kg-1.d-1)、通络方剂大剂量组(2.0g.kg-1.d-1)、褪黑素小剂量组(0.5mg.kg-1.d-1)、褪黑素大剂量组(10mg.kg-1.d-1)。糖尿病造模前预设鼠龄和体重相当的正常对照组7只。分组后即开始干预,治疗12周后,应用免疫组化方法检测各组大鼠视网膜NF-kB、VEGF的表达;图象分析仪测定阳性面积,计算出其表达量。应用RT-PCR方法检测NF-kB、VEGF mRNA的表达。结果:免疫组化显示正常对照组大鼠视网膜NF-kB、VEGF均有一定表达。糖尿病各组视网膜NF-kB表达较NC组明显增强(P<0.05);治疗组较糖尿病组表达有所减弱(P<0.05)。各组较NC组视网膜VEGF的表达明显增强(P<0.01),治疗组较糖尿病组表达有所减弱(P<0.05)。大剂量治疗组较小剂量可显著抑制NF-kB、VEGF表达(P<0.01)。糖尿病各组NF-kB、VEGF mRNA的表达与NC组比较差异显著(P<0.05);DM组与治疗组大鼠视网膜差异显著(P<0.05)。大剂量治疗组间较小剂量可明显抑制NF-kB、VEGF mRNA表达(P<0.05)。结论:从蛋白及mRNA水平证实通络方剂与褪黑素同样能有效抑制糖尿病大鼠视网膜细胞NF-kB、VEGF的表达,从而减少周细胞的凋亡,抑制新生血管的生成,缓解糖尿病视网膜病变的发展。第三部分通络方剂对糖尿病视网膜病变大鼠组织结构的作用目的:研究通络方剂对DR大鼠组织超微结构的影响。方法:链脲佐菌素(60mg/kg)诱导糖尿病大鼠模型,造模成功后继续饲养12周以建立DR大鼠模型,随后按体重和血糖随机分为5组:糖尿病对照组、通络方剂小剂量组(0.5g.kg-1.d-1)、通络方剂大剂量组(2.0g.kg-1.d-1)、褪黑素小剂量组(0.5mg.kg-1.d-1)、褪黑素大剂量组(10mg.kg-1.d-1)。糖尿病造模前预设鼠龄和体重相当的正常对照组7只。分组后即开始干预,治疗12周后,应用光镜、电镜观察各组大鼠视网膜组织结构的变化。结果:光镜:可见NC组微血管走行规则,管径粗细均一,无明显异常变化;糖尿病组大鼠视网膜微血管细胞明显减少,毛细血管迂曲,管径粗细不一,毛细血管呈囊性扩张。微血管超微结构:NC组大鼠视网膜微血管内皮细胞和周细胞内染色质分布均匀,细胞器、细胞核形态正常,基底膜结构清楚,连续完整。糖尿病大鼠视网膜微血管内皮细胞水肿,周细胞改变较内皮细胞重,基底膜增厚;线粒体肿胀变性,核染色质边集。管腔明显狭窄,甚至闭塞。通络方剂治疗后糖尿病大鼠光镜、电镜下视网膜微血管结构、视神经病变减轻。结论:通络方剂可减少毛细血管周细胞、内皮细胞的减少,抑制基底膜的增厚,减少新生血管的形成;减轻线粒体肿胀,嵴变短、消失,膜破裂等病理改变,保护细胞器的形态的完整。对糖尿病视网膜微血管病变有一定的保护作用。