姜黄素对自发性卒中型高血压大鼠脑卒中预防作用及机制脑卒中是引起人类致死和致残的主要原因之一,给个人、家庭、社会带来沉重的经济负担,严重影响个人的生活质量。因此通过对高危人群实施卒中预防,消除或减少影响高危人群健康的危险因素,显得尤为重要。近年来可食用类植物对卒中的预防作用由于其依从性好而且副作用少,因此越来越受到人们的重视。姜黄素(Curcumin)是一种植物多酚,其具有广泛的生物学效应,包括:抗癌、抗氧化、抗炎症因子、抗血小板聚集、降脂等作用。姜黄素通可过上调内皮型一氧化氮合酶(e NOS)的表达或磷酸化,提高内源性一氧化氮的生成,从而改善内皮功能。因此姜黄素的这些特性为其预防脑卒中提供了理论基础。在我们前期的预实验中,与对照组相比,给予姜黄素组大鼠的卒中发生时间明显延迟,生存时间明显延长,而且这种预防效应并非依赖血压的降低所致。因此姜黄素对脑卒中的预防作用机制尚不清楚。既往研究表明,血管内皮功能在心脑血管疾病的发生、发展中起到了至关重要的作用。内皮细胞的损伤和功能紊乱是动脉血管功能障碍的始动因素。血管内皮功能障碍主要表现为血管内皮依赖性舒张功能的受损,血管舒张功能的受损明显增加心脑血管疾病的风险。内皮源性的一氧化氮是一增加脑血流、保护脑血管的重要内源性物质,增加内皮细胞的一氧化氮的生成可以保护脑缺血区及缩小梗死面积。因此我们推测姜黄素可能参与降低氧化应激水平,保护血管内皮细胞,提高内皮细胞的一氧化氮的产量或活性,改善血管舒张功能有关。解偶联蛋白2(UCP2)是位于线粒体内膜上解偶联蛋白家族中一员,其主要功能是参与质子转运使氧化磷酸化脱偶联,同时也通过介导“质子漏”,负性调控活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的产生,从而减轻氧化应激(oxidative stress)反应。UCP2基因敲除小鼠出现动脉粥样硬化、高血压、血管舒张功能降低,而过表达UCP2后能减少因NF-kB激活而导致的内皮细胞凋亡,改善血管功能。因此我们推测姜黄素有可能通过上调UCP2蛋白的表达来保护内皮细胞,改善血管舒张功能,起到预防脑卒中的作用。为证实上述假设,我们以自发性卒中型高血压大鼠及脐静脉内皮细胞为研究对象,体内外实验相结合,主要研究:(1)姜黄素对大鼠卒中发生时间和生存率影响。(2)姜黄素抗氧化应激和改善血管功能的作用(3)ucp2在姜黄素抗氧化、调节内皮细胞自噬和凋亡中的作用。1.姜黄素对自发性卒中型高血压大鼠脑卒中的预防作用1.1方法和步骤1.1.1姜黄素对卒中型高血压大鼠血压、体重、生存率及卒中发生时间的影响8周龄20只雄性卒中型高血压大鼠随机分成姜黄素组和对照组。观察姜黄素对大鼠的血压、体重的影响,记录大鼠卒中发生时间及死亡时间。1.1.2姜黄素对颈内动脉血管功能的影响2组8周龄卒中型高血压大鼠给予同处理3周,处死大鼠后快速分离颈动脉行血管功能检测。1.1.3观察姜黄素对椎基底动脉及内皮细胞中的一氧化氮(no),氧化应激产物的影响利用daf-2da荧光探针检测椎基底动脉横切片血管环和脐静脉内皮细胞一氧化氮表达量。dhe染色检测血管壁及内皮细胞超氧阴离子(ros)浓度。硝酸还原法(试剂盒)检测试验大鼠血液中的一氧化氮浓度,lipidperoxidationmdaassaykit试剂盒检测血液中丙二醛(mda),wst法(试剂盒)检测超氧化物歧化酶(sod)。1.1.4姜黄素对颈动脉及内皮细胞解偶联蛋白2表达的影响利用rt-pcr检测实验大鼠颈动脉血管组织ucp2mrna的表达,免疫印迹法检测内皮细胞ucp2蛋白的表达,观察分析姜黄素对解偶联蛋白2的调节作用。1.1.5姜黄素对自噬和凋亡的影响免疫印迹法检测颈动脉组织及内皮细胞自噬标志蛋白lc3-11的表达,tunel染色法观察内皮细胞凋亡,初步观察分析姜黄素内皮细胞自噬及凋亡的调节作用。1.2研究结果1.2.1姜黄素对实验大鼠的体重、血压及脑组织/体重比无明显影响。与对照组相比,姜黄素饲养组大鼠的血压有下降趋势,但无统计学差异,2组大鼠质量及脑组织质量/大鼠质量之比也无统计学差异。1.2.2姜黄素延迟了卒中型高血压大鼠卒中发生时间及提高了大鼠的生存率与对照组相比,姜黄素饲养组大鼠卒中发生时间明显延迟,生存率明显提高,对照组大鼠在实验开始第2周时出现卒中,在6-8周达高峰,第3周开始死亡,在7-10周死亡达高峰期,而姜黄素组大鼠在第3周开始出现卒中现象,在8-10周达高峰,第3周开始死亡,10-15周死亡达高峰期。1.2.3姜黄素明显改善卒中型高血压大鼠颈动脉血管舒张功能在本部分实验中,我们检测了姜黄素饲养组与对照组大鼠的颈动脉舒张功能,结果发现,实验组大鼠颈动脉血管无论是对乙酰胆碱(内皮依赖性)或硝普钠(非内皮依赖性)的舒张血管的反应均明显强于对照组,提示姜黄素具有改善血管舒张功能的作用。同时我们也检测了血管对苯肾上腺素的收缩反应,结果提示两组大鼠颈动脉血管收缩反应并无统计学意义。1.2.4姜黄素增加卒中型高血压大鼠的颈动脉组织及血液中的一氧化氮含量,降低了氧化应激产物,增强了抗氧化能力。在本实验中我们检测了卒中型高血压大鼠颈动脉组织一氧化氮、活性氧簇的含量,与对照组相比,实验组颈动脉一氧化氮含量明显增加,而活性氧簇(ros)显著减少,同时我们也检测了血浆中的一氧化氮(no)、氧化应激标志物(丙二醛,mda)、超氧化物歧化酶(sod)的含量。与对照组相比,姜黄素组大鼠一氧化氮及超氧化物歧化酶含量明显提高,而氧化应激产物显著减少。结果提示:姜黄素有明显的抗氧化能力和增加一氧化氮作用。1.2.5解偶联蛋白2在姜黄素抗氧化中的作用。为观察解偶联蛋白2(ucp2)是否在参与了姜黄素抗氧化作用,我们利用rt-pcr方法检测了2组卒中型高血压大鼠颈动脉组织cup2mrna的表达,结果表明,姜黄素明显增加了颈动脉组织的ucp2mrna的表达。在体外实验中,我们利用过氧化氢诱导的内皮细胞损伤模型,进一步明确了姜黄素通过ucp2来发挥其抗氧化,保护内皮细胞的作用。1.2.6解偶联蛋白2在姜黄素调节细胞自噬及凋亡中的作用在体内实验中,我们发现姜黄素组卒中型高血压大鼠颈动脉组织细胞自噬标志性蛋白lc-3蛋白表达增强,为明确cup2是否参与了姜黄素对组织细胞的自噬及凋亡过程,我们利用过氧化氢诱导的内皮细胞损伤模型,进一步证实了姜黄素通过ucp2途径调节细胞的自噬与凋亡。1.3.1.姜黄素延迟了卒中型高血压大鼠卒中发生时间并且提高了生存率1.3.2.姜黄素改善了卒中型高血压大鼠的血管舒张功能1.3.3.姜黄素可能同过上调解偶联蛋白2(ucp2)来发挥抗氧化,增加细胞自噬、减少细胞凋亡来保护内皮细胞,进而增加血管内皮细胞一氧化氮生成,改善血管舒张功能,从而达到预防卒中的作用。2.肾近曲小管细胞多巴胺d3受体对多巴胺d4受体影响的机制研究肾脏近曲小管通过对水钠调节而在人体血压调控中发挥重要的作用,在肾脏中,70%的超滤液及全部的氨基酸及葡萄糖通过肾近曲小管重吸收,而在这一调控中,肾脏多巴胺受体起到了重要作用。肾脏多巴安受体按其药理特性及结构分d1类受体(d1、d5受体)及d2类受体(d2、d3、d4受体),所有多巴胺受体直接或间接的参与了对肾脏水钠及血压的调节。同为d2类受体的肾脏多巴胺d3、d4受体在肾近曲小管表达丰富。刺激d3受体肾脏尿钠排泄增加,多巴胺d3受体基因敲除小鼠肾脏尿钠排泄下降,血压升高。d4受体基因敲除小鼠收缩压及舒张压均明显高于正常小鼠,在肾脏近曲小管,刺激d4受体,钠-钾-atp酶(na+-k+-atpase)活性明显下降。既往研究表明,肾脏多巴胺受体各亚型当中存在交互作用,如刺激d3受体可增加d1受体的表达,增加d1受体所介导的水钠排泄功能。刺激d5受体同样也可以增加d1受体的功能。同时肾脏多巴系统与其它调节血压系统也存在交互作用,如多巴胺受体与血管紧张素受体之间的相互作用,刺激d1受体或d3受体抑制at1受体mrna或蛋白表达受到抑制。我们的前期实验表明,同为d2类受体的多巴胺d3、d4受体存在相互影响,在wky肾小管上皮细胞中,刺激d3受体,d4受体mrna及蛋白表达增强,而在shr肾小管上皮细胞中,这种作用消失,但其作用的分子信号机制并不清楚。该部分实验以wky肾近曲小管细胞及shr肾近曲小管细胞为研究对象,主要研究探讨d3受体对多巴胺d4受体功能和表达影响的可能机制,如d3与d4受体的共存和物理连接、d4受体的膜转位以及可能的信号分子,如plc、ip3、pkc。2.1主要方法和步骤2.1.1放线菌素(cycloheximide,chx))预处理细胞后,免疫印迹法检测d4受体蛋白的表达。2.1.2激光共聚焦检测d3受体及d4受体在肾小管上皮细胞膜转位,激光共聚焦和免疫共沉淀方法检测d3受体及d4受体在肾小管上皮细胞的共存和物理连接。1.3结论2.1.3不同信号分子的阻断剂预先处理肾小管上皮细胞后,d3受体激动剂pd128907孵育肾小管上皮细胞24小时,免疫印迹法检测d4受体蛋白表达。2.2研究结果2.2.1d3受体激动剂抑制wky肾近曲小管细胞d4受体蛋白降解在我们的前期实验中,我们发现d3受体激动剂pd128907增加wky细胞d4受体mrna和蛋白的表达,降低了shr细胞d4受体mrna和蛋白的表达,为进一步明确这效应的内在机制,我们在给予rpt细胞放线菌素(cycloheximide,chx))预处理,再给予pd128907处理细胞后检测d4受体表达,结果表明:wky细胞d4受体蛋白降解速度下降,而shr细胞无明显影响。提示:蛋白翻译后降解参与了这一效应。2.2.2pd128907增加d4受体对钠-钾-atp酶的抑制作用非受体膜转位依赖性。在我们的前期实验中,我们发现d3受体激动剂pd128907增加wky细胞d4受体对钠-钾-atp酶的抑制作用,而对shr细胞无明显影响,我们进一步研究发现:pd128907刺激wky和shr细胞后,胞内d3受体和d4受体膜转位并无明显区别,提示:pd128907增加d4受体对钠-钾-atp酶的抑制作用非受体膜转位依赖性。2.2.3d3受体及d4受体在肾小管上皮细胞内存在共存和物理连接现象在这部分实验中,我们采用激光共聚焦和免疫共沉淀方法观察了多巴胺d3受体和d4受体在肾近曲小管是否存在共存现象和直接作用,结果提示:d3受体和d4受体在肾近曲小管细胞内表达丰富且存在共存现象,d3受体激动剂pd128907处理wky(正常大鼠)细胞后,d3受体和d4受体的物理连接加强,这一作用在shr(原发性高血压大鼠)肾近曲小管细胞内消失。2.2.4d3受体对d4受体的功能影响通过plc/pkc途径在这部分实验中,我们分别使用磷脂酶c(plc)阻断剂和蛋白激酶c(pkc)预处理肾近曲小管细胞30分钟,再用d3受体激动剂孵育细胞24小时提取蛋白,免疫印迹检测d4受体的表达,结果表明:d3受体增强d4受体蛋白表达作用被plc及pkc阻断剂所阻断,提示:d3受体增强d4受体蛋白表达作用通过plc/pkc途径。2.3结论:2.3.1蛋白翻译后的降解机制参与了d3受体激动剂增强肾近曲小管细胞d4受体蛋白表达这一效应。2.3.2pd128907增加d4受体对钠-钾-atp酶的抑制作用依赖于受体蛋白表达而非依赖于受体膜转位。2.3.3 D3受体及D4受体在肾小管上皮细胞内存在共存和物理连接现象。2.3.4 D3受体对D4受体的蛋白表达和功能影响通过PLC/PKC途径。