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目的:子宫内膜癌是妇科常见的恶性肿瘤之一,它主要来源于子宫内膜腺体。在所有的妇科肿瘤中,子宫内膜癌的发病率和死亡率分别位于第二位和第三位。目前治疗子宫内膜癌方法有手术治疗、化疗和放疗,但对于晚期子宫内膜癌,这些方法的疗效仍然有限,从2008年至2018年,子宫内膜癌的死亡率增长了一倍。因此深入了解子宫内膜癌的发病机制以及找到这种致命性疾病潜在治疗靶点极为重要。RNA结合蛋白是细胞内非常重要的蛋白,它可以通过与编码RNA或非编码RNA相互作用,共同参与多种转录后调控过程,如RNA转运、剪接、定位和翻译等。越来越多的研究表明,由RNA结合蛋白介导的转录后调控对肿瘤的发生发展至关重要。胰岛素生长因子m RNA结合蛋白3（IGF2BP3）即是一种RNA结合蛋白,它作为胰岛素样生长因子m RNA结合蛋白家族中的一员,能够维持胚胎上皮组织的完整性。虽然已有学者用免疫组化的方法发现IGF2BP3在子宫内膜癌组织中表达增高,但是它在子宫内膜癌细胞中功能及机制研究尚无人报道。长链非编码RNA（lnc RNA）是含有至少200个碱基的不编码蛋白质的RNA转录本。它们可以在转录、转录后及翻译水平调节基因的表达,影响细胞的很多功能。目前人们已经发现很多lnc RNA分子参与了肿瘤的增殖、侵袭、迁移和耐药。虽然已有研究报道有些lnc RNA可以和IGF2BP3结合直接或间接的增加或降低下游m RNA的稳定性,从而影响肿瘤的进展,但人们对lnc RNAs在子宫内膜癌中是否调节IGF2BP3,以及其作用机制的了解仍然有限。本研究的目的是在子宫内膜癌细胞中找到与IGF2BP3相互作用的lnc RNA分子,观察两者相互作用是否可以改变子宫内膜癌的恶性生物学行为,并通过一系列分子机制的研究,为子宫内膜癌的风险评估、预后预测、诊断和治疗提供新思路和新靶点。研究方法:1.应用RT–q PCR及免疫组织化学染色的方法分别检测IGF2BP3在子宫内膜癌组织中的表达情况,并根据表达量的中位值,将内膜癌患者分为高表达组和低表达组,分析IGF2BP3的表达与子宫内膜癌的临床病理参数及总生存率的关系。2.利用IGF2BP3过表达和RNAi慢病毒,分别在子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC–1–A中构建过表达和敲低IGF2BP3的细胞。用CCK8和Ed U的方法观察敲低或过表达Ishikawa及HEC–1–A细胞中的IGF2BP3后,细胞的增殖能力是否发生变化,用Transwell实验观察敲低或过表达Ishikawa及HEC–1–A细胞中的IGF2BP3后,细胞的迁移和侵袭能力是否发生变化。3.利用RNA免疫共沉淀后测序技术及癌症基因组图谱（TCGA）数据库找到可能与IGF2BP3结合的lnc RNA,并通过RNA免疫共沉淀–q PCR方法和RNA pulldown实验分别在Ishikawa细胞和HEC–1–A细胞中加以验证。4.利用RT–q PCR方法检测子宫内膜癌组织中LINC00958的表达,并分析及其与临床病理特征之间的关系,用皮尔逊相关系数法分析子宫内膜癌组织中,LINC00958和IGF2BP3的表达是否具有相关性。5.利用LINC00958过表达和RNAi慢病毒,分别在Ishikawa和HEC–1–A细胞系中构建LINC00958过表达或敲减的细胞系。在过表达或敲减LINC00958的两种子宫内膜癌细胞系中,通过RT–q PCR和Western blot方法观察IGF2BP3 m RNA和蛋白水平是否相应发生变化。接着,在过表达和敲减IGF2BP3的两种子宫内膜癌细胞系中,再利用RT–q PCR方法观察LINC00958的表达是否发生变化。最后,RNA荧光原位杂交联合蛋白免疫荧光实验用来检测LINC00958与IGF2BP3的亚细胞定位。6.构建共转染慢病毒细胞系,用CCK–8和Ed U实验观察过表达IGF2BP3同时再敲减LINC00958,Ishikawa细胞和HEC–1–A细胞的增殖能力是如何变化的,用Transwell实验观察过表达IGF2BP3同时再敲减LINC00958,两种细胞的迁移和侵袭能力是如何变化的。7.利用转录组测序技术及TCGA数据库,找到Ishikawa细胞中LINC00958和IGF2BP3共同调节的可能的下游基因。利用过表达和RNAi慢病毒,过表达或敲减LINC00958和IGF2BP3在两种子宫内膜癌细胞中的表达后,RT–q PCR和Western blot法分别在Ishikawa细胞和HEC–1–A细胞中验证LINC00958和IGF2BP3对E2F3的调节作用。通过Western blot回复实验,判断IGF2BP3是否通过LINC00958调节E2F3蛋白的表达。8.利用RNAi技术,将E2F3小干扰RNA分别转染至Ishikawa细胞及HEC–1–A细胞中,通过CCK8,Ed U,transwell实验分别检测敲减Ishikawa和HEC-1–A细胞中的E2F3的表达水平后,细胞的增殖、迁移和侵袭能力是否发生变化。9.分别构建慢病毒和小干扰RNA共转染细胞,利用CCK8,Ed U,transwell实验观察过表达IGF2BP3同时再敲减E2F3,共转染细胞的增殖、迁移和侵袭能力的变化情况。10.裸鼠皮下移植瘤实验观察当将敲减或过表达IGF2BP3的HEC–1–A细胞以及过表达IGF2BP3同时敲减LINC00958的HEC–1–A细胞注入裸鼠皮下时,移植瘤的生长速度和体积的变化情况,同时用移植瘤做免疫组化,检测下游效应因子E2F3和增殖指标Ki67的表达。11.通过RNA降解实验,分别在两种子宫内膜癌细胞系中过表达LINC00958或敲减IGF2BP3,观察E2F3 m RNA半衰期的变化情况。利用回复实验,分析IGF2BP3是否经由LINC00958影响E2F3的稳定性,从而影响m RNA的产出。结果:1.IGF2BP3在子宫内膜癌组织中表达增高,高表达的IGF2BP3与肿瘤的分期（P=0.01）、分级（P=0.03）,是否有脉管浸润（P=0.03）和远处转移（P=0.047）相关,也与患者的不良预后相关（P=0.0334）。2.敲低IGF2BP3可抑制子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,过表达IGF2BP3可促进子宫内膜癌细胞的进展。3.将RNA免疫共沉淀测序结果和从TCGA数据库获得的差异表达基因列表取交集,共找到10个潜在的lnc RNA分子可能在子宫内膜癌中与IGF2BP3相结合,RNA免疫共沉淀–q PCR及RNA pulldown结果表明,只有LINC00958与IGF2BP3能够相互结合。4.LINC00958在子宫内膜癌组织中表达增高,高表达的LINC00958与肿瘤的分期（P=0.01）、是否有淋巴结转移（P=0.02）及是否有远处转移（P=0.03）有关。皮尔逊相关系数法分析结果表明,在子宫内膜癌组织中,LINC00958的表达和IGF2BP3的表达无明显相关性（R~2=0.035）。5.过表达或敲减Ishikawa细胞和HEC–1–A细胞中LINC00958表达后,IGF2BP3无论在m RNA水平还是蛋白水平,均未发生明显变化。同样的,过表达或敲减两种细胞中的IGF2BP3的表达后,LINC00958的表达也未发生明显变化。RNA荧光原位杂交及蛋白免疫荧光实验显示LINC00958和IGF2BP3主要在细胞浆发挥作用。6.功能回复实验结果表明,在Ishikawa及HEC–1–A细胞中,敲减LINC00958可部分回复过表达IGF2BP3所导致的细胞增殖、迁移及侵袭能力的增加。说明IGF2BP3是通过LINC00958影响内膜癌细胞恶性生物学行为。7.将Ishikawa细胞敲减LINC00958后的转录组测序结果和从TCGA数据库获得的与IGF2BP3共表达的基因列表取交集,共获得9个潜在的下游效应因子。RT–q PCR和Western blot结果证明当在Ishikawa和HEC–1–A细胞中敲减或过表达LINC00958及IGF2BP3后,只有E2F3的m RNA和蛋白水平发生相应变化,提示E2F3可能是两者共同调节的基因。而且回复实验证明,IGF2BP3可通过LINC00958调节E2F3蛋白表达。8.用小干扰RNA敲减两种内膜癌细胞中的E2F3后,细胞的增殖、迁移和侵袭能力均受到抑制,说明E2F3可能促进子宫内膜癌的发生发展。9.在Ishikawa和HEC–1–A细胞过表达IGF2BP3同时再敲低E2F3,可部分回复过表达IGF2BP3所产生的促癌作用。10.动物实验证明,敲低IGF2BP3可抑制移植瘤的生长,反之,过表达IGF2BP3可促进移植瘤的生长。免疫组化结果表明,敲低或过表达IGF2BP3后,E2F3和Ki67的蛋白表达量也相应的减少或增加。回复实验证明,IGF2BP3通过LINC00958影响移植瘤的生长,并影响E2F3和Ki67的表达。11.RNA降解实验表明,在Ishikawa和HEC-1–A细胞中,过表达LINC00958可延长E2F3的半衰期,敲减IGF2BP3可缩短E2F3的半衰期,过表达IGF2BP3同时敲减LINC00958可部分回复过表达IGF2BP3对E2F3 m RNA稳定性的影响以及m RNA的表达。结论:1.IGF2BP3在子宫内膜癌中高表达,其表达增高与许多较差的临床病理类型及不良预后相关。IGF2BP3可促进子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和侵袭。2.LINC00958可以和IGF2BP3在细胞浆相互结合,帮助IGF2BP3通过改变E2F3m RNA的稳定性,调节E2F3 m RNA的表达,进而影响子宫内膜癌的进展。