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研究背景胰腺癌是致死率最高的恶性肿瘤之一,侵袭性高、进展快、转移早是胰腺癌预后极差的最主要因素,但其侵袭转移分子机制尚待进一步阐明。MLH1(Mut L homologue l)作为DNA错配修复的关键基因,在结直肠癌、子宫内膜癌等多种肿瘤中研究广泛,但MLH1调控胰腺癌侵袭转移等恶性生物学行为的分子机制相关研究尚不充分。课题组在前期研究,发现错配修复基因的表达与患者良好预后正相关、与肿瘤分化程度和淋巴结转移呈显著负相关,提示MLH1可能对胰腺癌侵袭转移发挥抑制作用。因此,本研究拟探究MLH1在胰腺癌侵袭转移中的作用,为胰腺癌的精准靶向治疗提供潜在治疗靶点。研究目的基于TCGA数据库探究错配修复基因在胰腺癌中的可能作用;探索MLH1对胰腺癌增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为的影响;初步探究MLH1调控胰腺癌侵袭转移的分子机制。研究方法1、利用生物信息学方法分析错配修复基因MLH1、MSH2、MSH6在胰腺癌中的表达、功能富集、预后等,通过TCGA数据库的转录组数据初步探究错配修复基因在胰腺癌中可能的作用。2、利用实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹实验检测MLH1在胰腺癌细胞系中的表达情况,使用慢病毒转染筛选并建立稳定MLH1敲减、过表达以及相应对照组胰腺癌稳转细胞株。3、利用CCK-8细胞增殖实验、平板克隆形成实验检测MLH1表达对胰腺癌细胞体外增殖能力的影响;利用细胞划痕愈合实验、transwell小室迁移侵袭实验及裸鼠原位移植瘤模型探究MLH1表达对胰腺癌细胞体外及体内迁移侵袭能力的影响。4、利用转录组测序、拯救实验、组织样本免疫组化等方法初步探究MLH1调控胰腺癌侵袭转移可能的具体分子机制。研究结果1、基于TCGA数据库分析错配修复基因在胰腺癌中可能的作用TCGA数据库中,错配修复基因MLH1、MSH2、MSH6在胰腺癌组织和正常胰腺组织之间表达量没有显著差异,趋势上MLH1在胰腺癌组织中表达水平低于正常胰腺组织;MSH2与MSH6的表达呈显著正相关,MLH1表达与多个侵袭转移基因显著相关,MLH1差异表达基因富集在多个侵袭转移相关通路;Ⅰ期患者MLH1表达量显著高于Ⅱ期患者,T1/T2、NO患者中MLH1表达量较T3/T4、N1患者趋于升高;MSH2、MSH6高表达患者总生存期、无进展生存期、疾病特异性生存期均显著缩短(P<0.05),MSH2在预后多因素Cox回归分析中有统计学意义(P<0.05)。2、MLH1对胰腺癌恶性生物学行为的影响体外实验发现敲减MLH1后BxPC-3胰腺癌细胞增殖、迁移以及侵袭能力较对照组细胞显著增强,过表达MLH1后MIAPaCa-2胰腺癌细胞增殖、迁移以及侵袭能力较对照组细胞显著减弱(P<0.05)。体内实验发现,BxPC-3 MLH1敲减稳转细胞株的肝转移能力较对照组显著增强,而MLH1过表达稳转细胞株则相反(P<0.05)。3、MLH1对胰腺癌侵袭转移调控的作用机制转录组测序发现G蛋白偶联受体C家族5C(G Protein-Coupled Receptor Class C Group 5 Member C,GPRC5C)与MLH1 显著负相关(P<0.05),利用GEPIA2在线工具Pearson相关性分析、Spearman相关性分析、Kendall相关性分析均发现GPRC5C与MLH1在胰腺癌(PAAD-TCGA)肿瘤组织中的表达呈显著负相关(P<0.05);在细胞中,BxPC-3 MLH1敲减细胞在蛋白水平和转录水平,呈现MLH1下调,GPRC5C上调;MIAPaCa-2过表达稳转细胞株中则相反,MLH1与GPRC5C呈负相关;在裸鼠原位移植瘤中,BxPC-3 MLH1敲减组GPRC5C表达量增加,过表达组GPRC5C表达量减少,呈负相关;在人胰腺癌组织中,免疫组化结果发现MLH1高表达的患者GPRC5C呈低表达,MLH1低表达的患者GPRC5C呈高表达(P<0.05)。进一步拯救实验发现BxPC-3敲减稳转细胞株的体外增殖能力、迁移、侵袭能力在敲减GPRC5C后显著减弱(P<0.05),逆转MLH1缺失对胰腺癌细胞迁移与侵袭的促进作用。结论1、TCGA数据库中,趋势上MLH1在胰腺癌组织中表达量低于正常胰腺组织;MLH1可能参与调控胰腺癌侵袭转移;MSH2为胰腺癌不良预后的独立危险因素,可作为胰腺癌潜在的预后标志物。2、MLH1抑制胰腺癌细胞体外的增殖、克隆形成、迁移、侵袭、划痕愈合能力,抑制体内胰腺癌肝转移。3、MLH1在转录水平负调控GPRC5C抑制胰腺癌侵袭转移。