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脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是临床常见创伤,常导致四肢截瘫等严重后果。近年来,脊髓损伤及修复的有关研究取得很大进展,神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的发现及细胞移植被认为是治疗脊髓损伤的希望,是最有前景的方法之一。本实验目的旨在研究脊髓源性神经干细胞培养,增殖及定向诱导NSCs向神经元分化,为治疗脊髓损伤提供合适的种子细胞,为进一步细胞移植提供一定实验基础。实验一胚胎大鼠脊髓源性神经干细胞分离及体外培养从孕14d胚胎大鼠的脊髓中分离得到脊髓NSCs,采用无血清法培养并传代纯化.观察细胞生长状况及特性,进行神经巢蛋白抗原(neuroepithelial stem cell protein,Nestin)鉴定。结果:分离所得NSCs具有连续克隆能力,呈悬浮状态生长。在无血清培养条件下,脊髓源性NSCs快速增殖,48-72h内可形成细胞球(neurosphere),将这些细胞球吹打分离成单细胞后重新培养,单个的细胞又很快变成细胞球。免疫组化结果显示这些细胞表达nestin,证实为神经干细胞实验二褪黑素对鼠脊髓源性神经干细胞增殖及分化的影响取生长状态良好的脊髓NSCs,加入终浓度为100μmol/L、1μmol/L及10nmol/L的褪黑素(melatonin ,MT),采用细胞计数结合免疫荧光检测法,观察NSCs的生长增殖及分化状况。结果显示:100μmol/L的MT和1μmol/L的MT均能促进脊髓NSCs增殖;10nmol/L的MT则抑制脊髓NSCs增殖。3种浓度的MT均能使脊髓NSCs向神经元分化的比率增加[对照组和实验组的神经元分化比率分别为(23.6±2)%,(45.3±1)%,(42.5±2)%,(50.7±2)%]。结论:3种不同浓度的褪黑素对大鼠脊髓NSCs体外增殖有着不同的作用,但都促进其向神经元分化。实验三褪黑素与全反式维甲酸联合作用对胚胎大鼠脊髓神经干细胞分化的影响在实验一基础上,取第4代纯化脊髓NSCs经吹打分离成单细胞悬液,适当密度接种于未包被25cm2玻璃培养瓶,加入全反式维甲酸(all-trans retinoic acid ,ATRA )与不同浓度的MT组合.观察NSCs分化状况,细胞免疫化学荧光方法进行分化细胞类型鉴定,计算各组神经元分化比例,并进行统计学分析。结果:与对照组[(8.8±1 )%]比,单纯ATRA作用组神经元分化比率[(10.6±2) %]无明显差异;单纯MT作用组100μmol/L[(24.8±2) %]与10nmol/L MT[(23.4±1) %]两组都能明显促进脊髓NSCs向神经元分化,两组间比较无明显差异;ATRA与100μmol/L MT共同作用组[(53.9±2)%],进一步提高了脊髓NSCs向神经元分化的比率;ATRA与10nmol/L MT共同作用组[(26.7±2)%]也能促进脊髓NSCs向神经元方向分化(与对照组相比较),但其分化率与单一使用MT的两组比较无明显差异。结论:单纯应用不同浓度的MT都促进脊髓源性NSCs向神经元分化,但ATRA与不同浓度的MT联用对神经元分化率有着不同影响。