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研究背景:脓毒症(Sepsis)是临床危重症患者的严重并发症之一,发病急而凶险,病死率高。已知脓毒症是由促炎因子激活免疫细胞引起的严重组织损伤,尤其在脓毒症SIRS(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)阶段。其中单核巨噬细胞作为脓毒症中天然免疫反应中的抗感染细胞及特异性免疫中的抗原呈递细胞,其功能变化在脓毒症免疫抑制中的作用受到广泛关注。根据活化后表型及功能的不同巨噬细胞可分为经典激活巨噬细胞(M1)和替代激活巨噬细胞(M2)。前者分泌促炎细胞因子加重炎症,后者分泌白介素-10(IL-10)等炎症抑制因子改善过度炎症,促进组织修复。研究表明脓毒症时组织中M1型巨噬细胞显著增加,可能是导致脓毒症免疫瘫痪的机制之一。流行病学研究表明蠕虫感染与脓毒症之间存在反向关系。涉及的机制是蠕虫感染后通过阻断Toll样受体-4(TLR4)减少巨噬细胞向M1方向活化、促进转化生长因子-β(TGF-β)和IL-10等抗炎因子的释放,从而调节过度的炎症反应。尽管“蠕虫疗法”被认为安全有效,但活体寄生虫的应用仍具有不良副作用的风险。因此,采用蠕虫源性蛋白以代替蠕虫感染用于治疗脓毒症既可以避开感染蠕虫的缺点又可发挥治疗作用。本实验选用日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(r-SjCystatin)以观察其对巨噬细胞极化的调控能力并将r-SjCystatin极化的巨噬细胞过继转移应用于脓毒症小鼠,观察其治疗效果以探讨其对脓毒症的保护机制。目的:1.探究r-SjCystatin体外对巨噬细胞的调节作用2.观察过继转移r-SjCystatin调控的巨噬细胞对脓毒症小鼠的治疗效果并探讨蠕虫蛋白的潜在应用价值方法:1.构建、表达并纯化r-SjCystatin蛋白:取保存的菌种于培养基中进行菌种扩大培养,另外取一培养基进行诱导表达重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂;将培养上清经浓缩、透析后在低压层析系统中进行蛋白纯化;纯化后的蛋白再次进行透析过夜;再次获得的透析液经超滤管浓缩后,凝胶电泳鉴定目的蛋白、BCA测定蛋白浓度。2.获取小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)并培养至M-CSF存在的条件培养基中,5 d后流式检测(F4/80、CD11b)以鉴定成熟度。将此培养成熟的巨噬细胞分为阴性对照组(LPS组)、阳性对照组(IL-4+IL-10组)、单独蛋白组(r-SjCystatin组)及蛋白与LPS共刺激组(r-SjCystatin+LPS组)。干预24 h后收集细胞及上清,采用流式、免疫荧光检测M1型巨噬细胞极化指标(CD86)及M2型极化指标(CD206)。ELISA检测各组细胞培养上清中IFN-γ、IL-6、IL-10及TGF-β水平。3.采用盲肠穿孔术(CLP)制备小鼠脓毒症模型,将BALB/C小鼠随机分为4组:CLP组、CLP+BMDMs组、CLP+LPS-BMDMs组和CLP+r-SjCystatin-BMDMs组。CLP组:仅做脓毒症造模;CLP+BMDMs组:脓毒症造模后,过继转移巨噬细胞;CLP+LPS-BMDMs组:脓毒症造模后,过继转移LPS处理的巨噬细胞;CLP+r-SjCystatin-BMDMs组:脓毒症造模后,过继转移r-SjCystatin处理的巨噬细胞。CLP术后30 min,将提前制备好的各组细胞按1×106个细胞悬浮于100 ul PBS中进行小鼠尾静脉注射。于过继后12 h在麻醉下处死小鼠,留取血清和肾、心、肺、肝组织脏器。使用全自动生化仪检测小鼠血清中ALT(谷丙转氨酶)、AST(谷草转氨酶)、BUN(血尿素氮)和Cr(肌酐)水平;HE染色后进行组织病理学检查及组织学评分。结果:1.凝胶电泳鉴定结果显示,成功表达可溶性重组蛋白且纯化的r-SjCystatin蛋白相对分子质量(Mr)为11.3 k Da,与推导的肽基因产物的分子质量(11.3k Da)相当。2.流式结果显示,培养于M-CSF中的BMDMs成熟度显著高于空白组(P均<0.001)。与LPS组相比,r-SjCystatin及r-SjCystatin+LPS两组巨噬细胞中CD206+显著升高(P均<0.01)且细胞上清中IL-10、TGF-β水平明显增高,差异具有统计学意义(P<0.01);r-SjCystatin及r-SjCystatin+LPS两组巨噬细胞中CD86+较LPS组相比,显著下降(P均<0.001)且细胞上清IFN-γ、IL-6水平明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05);免疫荧光检测巨噬细胞极化数目,结果显示:r-SjCystatin及r-SjCystatin+LPS处理后BMDMs,M2型巨噬细胞数量增加。3.与CLP、CLP+LPS-BMDMs两组相比,过继转移r-SjCystatin处理的巨噬细胞小鼠血清中ALT、AST、BUN和Cr水平显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。同时,肾小球破坏、肾小管细胞水肿及炎性细胞浸润明显减轻;心肌纤维断裂及心肌细胞变性坏死明显缓解;肺泡充血、肺泡壁厚度和细胞浸润显著减轻;小鼠肝索紊乱、肝细胞肿胀及炎性细胞浸润显著缓解并且肾、心、肺及肝组织学评分显著降低(P<0.05)。结论:1.r-SjCystatin蛋白体外可调控BMDMs向具有抗炎特性的M2巨噬细胞极化,并抑制M1巨噬细胞的转化。2.过继转移r-SjCystatin调控的巨噬细胞可显著改善CLP小鼠脓毒症临床症状,改善组织器官损伤。