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辣椒(Capsicum annumL)属茄科,系茄果类蔬菜。原产于南美洲,现在已是全世界范围内被广泛消费的蔬菜和香料之一。辣椒中的辣味成分为辣椒素类物质,是具有辛辣刺激性的香草胺合成的衍生物,主要成分之一是辣椒素。国内对辣椒素类物质的研究主要集中在提取与加工上,而对辣椒素合成的分子生物学基础的研究很少。因此,有必要从基因方面对辣椒素合成相关基因进行研究。本实验用不同的辣椒材料研究辣椒素含量的合成规律;由于辣椒素是在胎座中合成的,辣椒素合成相关基因只在胎座中表达,因此,我们以胎座和果肉为材料,利用cDNA-AFLP技术进行差异显示分析,得到了以下结果:
1、辣椒素合成规律SAS统计软件分析HPLC的检测结果显示,辣椒素类物质的合成与品种、部位和合成时期显著相关。辣椒素类物质的含量以胎座最高、果肉次之,种子中最少;辣椒素类物质的合成都是先缓慢增加,在一定时期达到最大,而后逐渐减少。
2、AFLP体系的建立与优化对AFLP预扩增与选择性扩增体系中各组分的Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、r-Taq聚合酶的用量、连接产物和预扩产物的稀释以及预变性时间进行了优化筛选;确立了适用于辣椒AFLP的最佳反应体系:①预扩增体系:稀释20倍的连接产物取5μL此作模板,预扩引物0.4μM,r-Taq酶0.04U/μL,dNTP0.2mM,MgC122.0mM,预变性时间3min:②选扩增体系:预扩产物稀释30倍,选扩引物0.6μM,其余组分同预扩体系。
3、胎座和果肉基因表达差异的cDNA-AFLP分析利用cDNA-AFLP技术分析了朝天椒在开花后25D的胎座和果肉(辣椒素类物质相差达到49倍)的基因表达差异。64对引物组合共得到169条差异片段,经过回收、克隆、测序、比对,除去重复片段,得到82条非冗余的差异表达片段。这些差异片段分别属于电子传递和能量途径、转录调控、防卫与胁迫反应、蛋白质代谢、信号转导、转运通道、未知或假想蛋白、无相似性序列等。其中,后两者所占比例约50%,共41条,它们所对应的同源基因功能未知,有可能为新基因片段。
4、部分代表基因在辣椒不同部位的表达特征分析从筛选的82条基因片段中选择10条代表5个类型,用RT-PCR技术、Actin做内参,检测这些基因在辣椒的胎座、果肉、种子、花和叶子的表达情况,水做对照。只筛选到13-3能在胎座中特异的表达,初步断定这个基因可能与辣椒素的合成相关。