研究目的探究注射用血栓通(XST)抗血小板聚集的生物力药理学机制。研究背景血小板的活化与聚集是心脑血管疾病发生发展的关键环节,抗血小板聚集已经成为防治心脑血管疾病的重要手段。XST作为传统中医临床常用活血化瘀中药,其主要有效成分为三七总皂苷。本课题组前期研究结果发现,三七总皂苷对凝血酶、二磷酸腺苷(ADP)以及胶原诱导的血小板聚集具有明显的抑制作用,且发现血流力学环境会影响三七总皂苷抗栓及抗炎效应。因此推测,三七总皂苷可能通过抑制血小板聚集,改善生物体血流力学环境从而发挥活血化瘀的整体效应。血栓形成是血管、血液及力学环境交互作用的复杂过程。研究发现,血小板是敏感的力学感受器。异常的血流剪切力可以诱导血小板活化聚集,进而影响血栓发生发展过程。目前已知的剪切诱导相关的血小板聚集机制多是高剪切条件下vWF与血小板膜蛋白GPIbα结合相关。进一步研究发现,血小板膜表面存在机械离子通道Piezo1蛋白,其可感受血流剪切力,影响Ca2+内流,从而影响血小板的活化聚集。因此,本实验以XST为研究对象,体内建立角叉菜胶诱导的血栓模型,探究XST对血栓及血流的影响:体外实验部分利用Bioflux1000z控剪应力微流培养系统,模拟体内高剪切血流力学环境,探索XST对vWF介导的血小板粘附及滚动的影响;模拟体内不同水平的流动力学条件,检测不同流动条件下XST对血小板聚集的影响;利用荧光显微镜探索XST对流动条件下Ca2+荧光强度的影响;采用Western blot法研究不同条件下XST对血小板Piezo1及其相关蛋白表达影响。探究XST对血栓形成及血流状态的影响以及XST抗剪切诱导血小板聚集的生物力药理学机制。研究内容1.XST对血栓形成及血流状态的影响50只雄性SD大鼠随机分为5组,即正常组、模型组、阳性对照肝素钠组(1000 U·kg-1)XST低、高剂量组(50、150 mg·kg-1)。连续腹腔注射给药10d,正常及模型组大鼠给予等体积生理盐水;在第7天给药1 h后尾静脉注射1 mg·kg-1角叉菜胶建立大鼠血栓模型。造模后2 h,6 h,24 h,48 h测量大鼠黑尾长度;以Vevo2100小动物超声成像系统检测大鼠颈总动脉血管内径、血流速度等指标并计算其血流量及血流剪切率;以激光散斑血流成像系统检测大鼠股、尾部微循环血流灌注量;以血小板聚集仪检测血小板最大聚集率;以HE染色法观察大鼠尾部组织及血管病理学变化;以Western blot法检测血小板Piezo1蛋白含量。2.高剪切条件下XST对vWF介导的血小板粘附及滚动的影响建立高剪切流动条件下vWF介导的血小板粘附及滚动模型。选择70 μg·mL-1的vWF铺被微流通道。正常大鼠腹腔注射3.0%戊巴比妥钠进行麻醉,腹主动脉取血后加入3.8%枸橼酸钠(抗凝比例1:9)抗凝。在Bioflux48孔板的进液孔加入270μL全血及30mLXST(0.15 g·L-1、0.6 g·L-1),溶剂对照组加入等量生理盐水,施加3000s-1剪切率灌注通道10 min。吸弃剩余全血,各孔加入PBS润洗3次。然后在进液孔中加入含有100μL各浓度药物的1mL HBSS缓冲液,施加1000 s-1剪切率冲洗通道至红细胞不可见。然后施加6000 s-1剪切率,利用全自动活细胞成像系统(Brightfield采集模块)实时观察并记录血小板滚动情况。3.不同剪切条件下XST对血小板聚集的影响正常大鼠腹主动脉取血后制备PRP,使用Tyrode-血小板缓冲液将PRP调整至0.5×108/mL。将PRP与Calcein-AM荧光染液室温避光孵育1 h后将载有荧光染液的PRP分别与XST(0.15g·L-1、0.6g·L-1)、GsMTx-4抑制剂(2.5 μmol·L-1)、Yoda1激动剂(25 μmol·L-1)、XST 联合 Yoda1(0.15 g·L-1+25 μmol·L-1、0.6 g·L-1+25 μmol·L-1)以及溶剂对照组给予相同体积量的生理盐水孵育5 min。将孵育好的PRP加入提前铺被好胶原(40 μg·mL-1)的Bioflux48孔板内,采用Bioflux1000z 控剪应力微流培养系统施加 400 s-1,1000 s-1,2000 s-1,4000 s-1,8000 s-1剪切率,每种剪切率时间设为5 min,利用全自动活细胞成像系统(FITC荧光采集模块)实时观察并记录血小板聚集情况。4.流动条件下XST对血小板Ca2+内流的影响正常大鼠腹主动脉取血后制备WP,将WP与Fluo-3 AM荧光染液37℃避光孵育45 min。洗去多余荧光染液并调整WP至3×108/mL。将载有荧光染液的WP加入预先铺被胶原的Bioflux24孔板的A孔,将配制好的含有1 mmol·L-1 Ca2+的各组药物,即 XST(0.15g·L-1)、GsMTx-4 抑制剂(2.5 μmol·L-1)、Yoda1 激动剂(25μmol·L-1)、XST 联合 Yoda1(0.15 g·L-1+25 μmol·L-1)以及溶剂对照组给予等体积生理盐水,加入相应的B孔内。利用Bioflux1000z控剪应力微流系统将A孔中的WP悬液以0.066 psi的压力(相当于200 s-1剪切速率)灌注到微流体通道中,压力持续2 min。停止对A孔施加压力后,在B孔处施加0.165 psi的压力(相当于1000s-1剪切速率),将B孔中的药物灌注到微流通道内,压力持续10 min。通过荧光显微镜和全自动成像系统(波长FITC;曝光时间400 ms)每30 s捕获血小板内Ca2+的荧光显微图像。5.不同条件下XST对血小板Piezo1相关蛋白表达的影响静态条件下:将大鼠 WP 与 XST(0.15 g·L-1、0.6 g·L-1)、GsMTx-4(2.5μmol·L-1)、Yoda1(25μmol·L-1)以及盐水预孵育 WP 10 min 后,加入 ADP(10μmol·L-1)诱导血小板活化30 min。裂解血小板,提取血小板总蛋白,利用Western blot法检测血小板Piezo1蛋白的表达。流动条件下:将大鼠 WP 与 XST(0.15 g·L-1、0.6 g·L-1)、GsMTx-4(2.5μmol·L-1)、Yoda1(25μmol·L-1)、XST 联合 Yoda1(0.15 g·L-1+25 μmol·L-1、0.6g·L-1+25μmol·L-1)以及盐水预先孵育 10 min,除正常对照组外,利用Bioflux1000z 施加 1000 s-1、4000 s-1 及 10000 s-1 剪切诱导血小板活化 30 min。裂解血小板,提取血小板总蛋白,利用Western blot法检测血小板Piezo1蛋白、Calpain-2蛋白、Talin1蛋白及Vinculin蛋白的表达。实验结果1.XST对血栓形成及血流状态的影响结果显示,XST可抑制角义菜胶诱导的大鼠尾部血栓形成,明显缩短黑尾长度(P<0.05);与模型组相比,XSTL组可明显增高大鼠颈总动脉血流量(P<0.05);XSTH组可明显改善大鼠尾部微循环血流灌注量(P<0.05);XSTH组可明显抑制血小板聚集率(P<0.05);XSTL剂量组可明显增多血小板Piezo1蛋白表达(P<0.01)。2.高剪切流动条件下XST对vWF介导的血小板粘附及滚动的影响在高剪切力条件下,随着vWF浓度增大,血小板粘附增多。选用70μg·mL-11浓度的vWF作为评价XST对血小板粘附及滚动的影响。结果显示,与溶剂对照组相比,XST对vWF介导的血小板粘附及滚动无明显影响。3.不同剪切流动条件下XST对血小板聚集的影响结果显示,血小板聚集率随剪切率增大而增大。与溶剂对照组相比,XST显著抑制剪切诱导血小板聚集,并呈剂量依赖关系;量化统计分析结果显示,XSTL及XSTH组均可明显降低在生理剪切速率为1000 s-1-2000 s-1和病理性高剪切速率为4000 s-1-8000 s-1下形成的聚集体的数量和聚集面积(P<0.05或P<0.01);与Yoda1组相比,Yoda1联合XST-L及XST-H组可明显抑制血小板聚集,平均抑制率分别达到66.37%及78.63%(P<0.01)。4.流动条件下XST对血小板Ca2+内流的影响在剪切速率为1000 s-1条件下,各组Ca2+荧光强度随时间累积逐渐增加。动脉剪切1000 s-1导致血小板中Ca2+内流持续增加至93.72%。与模型组相比,GsMTx-4和XST组血小板内Ca2+荧光强度明显减少了 32.04%及25.31%(P<0.01),而Yoda1组Ca2+荧光强度增强了 58.04%。与Yoda1组相比,Yoda1联合XST组血小板Ca2+荧光强度明显降低了 39.91%(P<0.05)。5.不同条件下XST对血小板Piezo1相关蛋白的影响静态条件下,XST对血小板Piezo1蛋白的表达无明显影响。在1000 s-1、4000 s-1及10000 s-1剪应条件下,血小板Piezo1蛋白表达量与静态相比明显增多;而药物对Piezo 1蛋白的表达无明显影响。在4000 s-1剪应力下,用GsMTx-4、Yoda1及XST处理过血小板Calpain-2及Vinculin蛋白无明显变化。高剪切流动条件下检测到血小板Talin1被裂解为230kDa及190kDa分子量。经Yoda1处理后,血小板230kDa Talin1蛋白量显著降低32%(P<0.01);190kDa Talin1 蛋白量显著增加 64%(P<0.01)。而 XST(0.15 g·L-1)联合 Yoda1组明显降低了 230kDa Ta1in1 的表达(P<0.01),XST(0.6g·L-1)联合 Yoda1 处理显著降低了 190kDa Talin1的表达(P<0.05)结论1.XST可明显抑制血小板活化聚集,改善大鼠血流状态,维持血流正常力学环境,从而发挥抗血栓的效果;2.XST对高剪切力条件下vWF介导的血小板粘附及滚动无明显影响,这提示XST抗剪切诱导血小板聚集机制可能不是通过vWF-GPIba途径发挥作用;3.XST可明显抑制剪切诱导血小板聚集,其作用机制可能与抑制血小板机械力离子通道Piezo1蛋白的活化并抑制Ca2+内流相关;4.XST抑制了 Piezo1的活化并减少了Ca2+内流,从而影响到了 Calpain-2的活性,使得其切割Talin1的功能减弱,Talin1分子不能有效募集至血小板整联蛋白GPⅡbⅢa,从而影响血小板聚集及血栓形成。