镁金属及其合金作为一种可降解医用金属材料越来越受到人们的关注,其应用历史已有200年之久,具有弹性模量低、可降解、毒性小、有生物活性等优点。到目前为止,镁促进骨再生的机制仍然不十分清楚。有研究发现,镁内植物材料在生物体内骨组织周围降解的过程中,植入物周围镁离子浓度会增高,这一现象会显著地促进新生骨组织的形成。还有研究发现,向骨内植物材料中添加镁离子,可以很好地促进新骨形成。另外,近年的研究表明,PI3K/Akt信号通路能调控成骨细胞的增殖、分化。因此我们猜想,镁金属对于骨再生的促进作用,是通过其降解产物镁离子激活PI3K/Akt信号通路来实现的。探讨镁离子促进成骨细胞生物学行为的机制,将为医用镁基生物材料的未来临床应用提供了很好的理论参考价值。目的:研究不同浓度镁离子对成骨细胞生物学行为的影响,并探讨镁基生物材料促进骨再生的机制。方法:1.将氯化镁融入DMEM培养液中,制备成浓度为50 m M的镁离子溶液。以含有0.8 m M镁离子的DMEM培养液作为对照组,将制备好的50 m M的镁离子溶液通过无菌过滤器加入DMEM培养液中,制备成6 m M、10 m M和18 m M的镁离子溶液。2.无菌条件下分离培养大鼠乳鼠颅骨成骨细胞,将第2-3代成骨细胞以5×104个/毫升的浓度按以下分组进行接种培养:(1)DMEM培养液(DMEM);(2)6 m M镁离子组(6 m M);(3)10 m M镁离子组(10 m M);(4)18 m M镁离子组(18 m M);(5)10 m M+wortmannin(10 m M+W)。观察培养细胞形态学变化。3.通过罗丹明鬼笔环肽染色法测定不同浓度镁离子对成骨细胞粘附的影响,通过MTT法测定不同浓度镁离子对成骨细胞活力的影响,通过ALP活力、茜素红染色法、成骨分化相关基因的表达等实验测定不同浓度镁离子对成骨细胞分化的影响。通过western blot法测定镁离子对PI3K/Akt信号通路的表达的影响,并通过半定量分析比较各组之间的差异。通过向10 m M镁离子组加入PI3K/Akt信号通路特异性抑制剂wortmannin,进一步验证了PI3K/Akt信号通路对成骨细胞生物学行为的影响。结果:通过罗丹明鬼笔环肽染色实验、MTT实验、ALP活力检测、茜素红染色、成骨分化相关基因的表达等实验我们发现,6 m M、10 m M镁离子组成骨细胞粘附、成骨细胞活力、ALP活力、基质矿化水平、成骨分化相关基因的表达水平较对照组明显增加,差别具有统计学意义(p<0.05),更高浓度镁离子组(18 m M)成骨细胞粘附、成骨细胞活力、ALP活力、基质矿化水平、成骨分化相关基因的表达水平较对照组明显降低,差别具有统计学意义(p<0.05)。Western blot实验结果显示,6 m M组和10 m M组中磷酸化Akt(p-Akt)的表达水平较对照组明显增加,差异具有统计学意义(p<0.05)。而18 m M的镁离子浓度对磷酸化Akt(p-Akt)的表达水平具有明显的抑制作用,差异均具有统计学意义(p<0.05)。向10 m M镁离子浓度组中加入PI3K/Akt信号通路的特异性抑制剂wortmannin后,10 m M镁离子浓度对PI3K/Akt信号通路激活作用明显地被wortmannin有效逆转。由于之前的实验结果表明,10 m M镁离子浓度对成骨细胞的生物学行为的促进作用最为明显,因此,通过向10 m M镁离子组加入PI3K/Akt信号通路特异性抑制剂wortmannin后,成骨细胞粘附、成骨细胞活力、ALP活力、基质矿化水平、成骨分化相关基因的表达水平均受到抑制,这进一步验证了PI3K/Akt信号通路对成骨细胞生物学行为的影响。结论:适当浓度镁离子(6-10 m M)促进成骨细胞的活力和分化,而过高浓度镁离子(18m M)对成骨细胞的活力和分化具有抑制作用。镁金属促进骨再生的机制是镁离子通过激活PI3K/Akt信号通路促进成骨细胞的活力和分化来完成的。这项研究为医用镁基生物材料的未来临床应用提供了很好的理论参考价值。