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大量研究表明氧化应激与多种慢性病和急性病,如心血管疾病、癌症、神经紊乱、糖尿病、缺血再灌注和衰老等,有着密切的联系,而抗氧化肽可以参与机体内自由基的清除,从而阻止或降低活性氧对机体的伤害。本课题以鹰嘴豆生物活性肽为材料,以结肠腺癌细胞Caco-2和结直肠癌细胞HT-29为研究对象,研究鹰嘴豆生物活性肽对H2O2诱导的氧化损伤细胞(Caco-2和HT-29)的抗氧化效果以及信号通路Nrf2-Keap1的调控作用,初步探讨鹰嘴豆生物活性肽的抗氧化机制。主要实验结果如下:首先,考察鹰嘴豆生物活性肽对自由基的清除能力。随着活性肽浓度的增大,清除DPPH·和O2—·的能力逐渐增强。活性肽浓度为10mg/mL时DPPH·清除率可达79.2%,O—2·抑制率达到60.0%。实验结果表明鹰嘴豆生物活性肽有较好的抗氧化能力。其次,用不同浓度鹰嘴豆生物活性肽处理细胞后,继而用H2O2作用。测定细胞内的过氧化氢酶(CAT)活力、谷胱甘肽还原酶(GSH-Rx)活力、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力和丙二醛(MDA)含量的变化。在Caco-2细胞中,与阳性对照组相比,当鹰嘴豆生物活性肽浓度为0.5mg/mL时,CAT酶活力、GSH-Rx酶活力和GSH-Px酶活力分别提高了40.2%、54.0%和101.5%;HT-29细胞中,与阳性对照组相比,浓度为0.5mg/mL的鹰嘴豆生物活性肽处理后的细胞内CAT酶活力、GSH-Rx活力和GSH-Px酶活力分别提高了33.2%、31.0%和102.0%。实验结果表明鹰嘴豆生物活性肽对H2O2诱导的氧化损伤细胞有保护作用。再次,采用RT-PCR的方法对Nrf2及其调控的下游抗氧化酶基因(血红素氧合酶HO-1、谷氨酰半胱氨酸合成酶γ-GCS和醌氧化还原酶NQO1)的mRNA的表达量进行测定。实验结果表明,与阳性对照组相比,经鹰嘴豆生物活性肽处理的Caco-2细胞中的Nrf2、HO-1、γ-GCS和NQO1的mRNA的表达量分别增加了3.1、3.0、3.4和3.5倍;HT-29细胞中的Nrf2、HO-1、γ-GCS和NQO1的mRNA的表达量分别增加了2.9、3.0、3.6和3.2倍。实验结果表明活性肽处理后的细胞Nrf2、NQO1、HO-1和γ-GCS的mRNA表达量均有显著性升高,活性肽对Caco-2细胞和HT-29细胞有明显的保护作用。最后,采用Western Blot方法对Nrf2及其调控的下游抗氧化酶(HO-1、γ-GCS、NQO1以及GAPDH)的蛋白表达量进行测定。实验结果表明,随着鹰嘴豆生物活性肽浓度的增大,Caco-2细胞和HT-29细胞内的Nrf2和抗氧化酶的蛋白表达量呈现出增大的趋势。通过mRNA表达量的变化和蛋白表达量的变化发现鹰嘴豆生物活性肽能够激活Nrf2-Keap1信号通路,引起Nrf2从Keap1上解离,进而促使下游目的基因的转录和表达,证明鹰嘴豆生物活性肽对氧化损伤的Caco-2细胞和HT-29细胞具有显著的保护作用,在与氧化应激有关的慢性疾病的预防中有着良好的应用前景。