1.水稻黄绿叶突变体520ys的图位克隆叶绿体是植物光合作用结构和功能的基本单位,而叶绿素是叶绿体进行光合作用的主要色素,所以叶绿素含量的变化直接关系到植物的光合作用。通过对水稻叶色突变体的研究可以了解光合色素的代谢途径和叶绿体的发育机制等,进而可深入研究水稻的光合作用机制,为植物高光效提供理论基础,也为选育高光效水稻品种提供提高产量的途径。本研究通过甲基磺酸乙酯(EM S)诱变得到了一份水稻黄绿叶突变体520ys,对该突变体进行遗传分析、基因定位、候选基因筛选和功能验证等研究,主要结果如下:(1)表型观察及农艺性状分析:520ys整个生育期都表现为黄绿叶,生长延缓,抽穗期推迟;农艺性状调查结果显示,每株有效穗数、结实率和千粒重极显著减少,分别减少了 20.0%、11.6%和5.4%,株高显著下降,下降了 3.6%,说明520ys突变基因对植株的生长产生了较大影响。(2)光合色素含量测定:520ys苗期和抽穗期色素含量均极显著低于野生型,其中苗期叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和总叶绿素的含量分别下降了 52.5%、79.5%、29.3%和58.0%,叶绿素a/b的比值则增长了 124.3%;抽穗期叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和总叶绿素的含量分别下降了 59.5%、82.9%、59.2%和63.7%,叶绿素a/b的比值增长了 143.1%,表明520ys突变体光合色素合成受阻。(3)叶绿体超微结构观察:取4周龄苗期叶片进行透射电子显微镜观察,结果显示:520ys叶绿体内类囊体发育紊乱,尤明显基粒片层垛叠,且富含囊泡状结构,嗜饿颗粒数量明显增加。表明520ys突变体叶绿体发育受到抑制。(4)遗传分析及基因定位:遗传分析显示520ys突变性状受一对隐性核基因控制,将目标基因定位在第7染色体长臂InDe1标记X3和微卫星标记RM21725之间167.6 kb范围内,遗传距离分别为0.60 cM与0.42 cM。(5)候选基因的筛选、验证及生物信息学分析:对167.6 kb范围内的21个基因进行测序和分析,结果显示该区间一个编码未知蛋白基因内碱基发生替换,即在编码区的415bp处由碱基G突变为A,造成编码的氨基酸第139由丙氨酸(Ala)突变为苏氨酸(Thr)。该基因DNA全长1696 bp,含有2个外显子和1个内含子,CDS全长5 19 bp,编码一个含有172个氨基酸的蛋白质。根据预测,该基因编码蛋白质N端含有28个氨基酸组成的叶绿体信号.肽,第114-146位含33个氨基酸残基组成的ANK(Ankyrin repeat motif)重复序列,为锚蛋白家族。520YS蛋白存在于高等植物、绿藻和苔藓中,系统进化树分析表明,520YS与高粱和玉米等单子叶植物亲缘关系更为密切,蛋白序列同源性都高达77%。(6)转基因功能验证:构建转基因表达载体pC2300-actin-520YS,通过农杆菌介导法将野生型基因转入突变体中,获得的阳性转基因植株均表现为绿色,光合色素含量均恢复到正常野生型水平,说明该黄绿叶突变性状是由520YS基因突变所引起。(7)表达模式分析:RT-PCR检测520YS基因在苗期和孕穗期各个组织的表达模式,结果显示,520YS基因在叶片、叶鞘、幼穗和茎中表达,而在根中没有表达。说明该基因仅在绿色组织中表达。(8)亚细胞定位:将520YS基因连接到pC2300-35S-eGFP表达载体上,通过PEG介导转入水稻原生质体,利用激光共聚焦显微镜观察显示,GFP绿色荧光与叶绿素自发红光重合,说明520YS蛋白定位在叶绿体上。2.水稻矮秆突变体d6218的遗传分析及基因定位株高作为组成水稻株型的重要农艺性状,与光合效率和抗倒伏等密切相关,是影响水稻产量的主要因素之一。因此,水稻株高分子机理的研究对水稻育种具有非常重要的理论指导意义。本实验材料是在育种过程中,从178R/LP213杂交F2代中分离得到的矮秆突变体d6218,通过对该矮秆突变体进行表型鉴定、遗传分析和基因定位,为进一步对候选基因的筛选和功能的验证奠定基础。(1)表型特征及农艺性状分析:d6218从杂合亲本中分离出来,苗期无明显差异,在生育期62天左右才逐渐出现矮化性状,到成熟期株高不到正常植株的一半,叶片缩短、窄且直立,叶色浓绿,还表现出育性下降甚至不育。(2)遗传分析及基因定位:遗传分析表明d6218矮秆突变性状由一对隐性核基因调控。利用分子标记将d6218精细定位在水稻第10染色体末端,SSR标记X13和RM6673之间,分别相距0.28cM与0.14cM,物理距离为88.0kb。该区间尚未有矮秆基因的报道,认为是一个新的水稻矮秆基因,暂且命名为d6218。