论文部分内容阅读
近几年来,曾危害中国和东亚其它国家的水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)引起的水稻条纹叶枯病在中国又呈上升趋势,2000~2003年在江苏、河南等省市的一些地区大范围暴发,而在云南、山东、北京、辽宁、福建、浙江、上海、河北和四川等地则持续发生或流行.RSV仅由灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen)持久性经卵传播,水稻条纹叶枯的发病情况直接与灰飞虱的分布、繁殖、迁移等相关,因而RSV与灰飞虱之间的互作机制的研究,有助于进一步了解水稻条纹叶枯的发病规律,可以为从传播介体着手来防治该病提供很多启发.避开仅从昆虫病理学角度来研究RSV与灰飞虱互作机制的老路,以昆虫细胞培养技术建立灰飞虱体外培养单层细胞株,从而建立新的病毒与介体的研究模式,为从细胞和分子水平上研究RSV与灰飞虱互作机制创造良好的条件.因而,该研究以灰飞虱组织细胞的原代培养作为研究的主要内容.借鉴前人的细胞培养经验,特别是昆虫细胞培养经验,该研究开展了灰飞虱组织细胞的原代培养.细胞原代培养的第一步是从卵或虫体中分离出组织细胞,该实验比较了显微玻璃微针分离法和显微银针解剖法,结果后一种方法可在较短的时间内、更方便地从卵或虫体中无菌分离出组织块,从而解决了灰飞虱组织分离时的易被其共生真菌污染、费时劳神等困难.组织块分离出来后,为了能获得单个的、有培养前景的细胞,该实验又研究了低浓度的胰蛋白酶在其最适温度和最适pH条件下,获得分离程度适宜的组织块的不同酶解时间,结果0.25％的胰蛋白酶在37℃、pH8.0的条件下酶解组织块的最适时间是5~10min.该实验以灰飞虱的四种组织:中后期胚胎(胸节期或腹节期胚胎)、若虫头部组织、成虫的精巢和卵巢为材料进行了培养实验.并以较常用的昆虫培养基Grace培养基为基础,试验了胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)和新生牛血清(New Bovine Serum,NBS)、水解乳蛋白(Hydrolysate lactalbumin,HL)、酵母抽提物(Yeast extract,YE)等添加因子的各种水平的组合对分离组织细胞培养的影响;结果表明,在同样的条件下,中后期胚胎较其它供试材料都易培养,表现在分离出的贴壁组织细胞多,贴壁生长期较长;而且,以配方:等份Grace和MM培养基再添加20％FBS,维持胚胎组织细胞培养时间最长、效果最好,表明实验获得了适合灰飞虱组织细胞、特别是胚胎组织细胞生长的较好的培养基配方组合,从而使培养的理化条件(pH、渗透压、各种营养因子等)获得了优化.四种组织的培养难易程度和分离出的细胞形态的不同,说明存在着组织表达的差异,为了从转录水平上来认识它们的差异,甚而获得与细胞培养难易相关的基因及其表达产物,该实验还采用了RAPD分析的方法进行了这四种组织:中后期虫卵胚胎、若虫头部组织、成虫的精巢和卵巢的mRNA表达差异研究,结果表明:从发育方向上看,四种组织的表达差异有分化越大差异系数越大的趋势,而在相同条件下则越难培养.