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本研究旨在分离番木瓜采后在果实中特异表达的基因,进而鉴定这些基因在番木瓜果实成熟过程中的作用。对采后自然成熟番木瓜果实的硬度变化情况进行了研究。结果表明,番木瓜果实采后自然成熟条件下硬度呈逐渐下降趋势。将采后番木瓜果实按果皮颜色可分为六级,其中一级硬度为14.7kg/cm2,六级为2.0kg/cm2,结合Paull(1996)对采后番木瓜乙烯变化的结论:乙烯含量在果色破色前(一级)最微,到开始变软(三至四级)时达到高峰以后迅速下降,而此时番木瓜还没有达到食用风味最佳,也没有达到成熟,因此相比而言我们使用硬度为指标进行选择比较方便可行。当番木瓜为五级时,食用风味最佳,糖分和芳香味等指标都达到最好的程度。根据这一结果,选取采后一级和五级番木瓜果实(1号、2号),以2号作为检测子、1号作为驱动子,进行正向抑制差减杂交。用T/A法构建正向差减文库(含221个克隆)。采用PCR方法筛选正向差减文库获得138个重组子,对这些重组子进行array(反向Northern点杂交),筛选出在1号和2号中表达有明显差异的cDNA片段67个,再对这些筛选出的cDNA插入片段进行了序列测定,结果表明:共有58个cDNA的测序结果可进行BLASTn和BLASTx分析。其中:22个cDNA序列与数据库中功能未知的核酸序列的同源性达60~90%,占总cDNA片段的38%;32个cDNA序列推导出的氨基酸序列与功能己知的cDNA推导出的氨基酸序列同源性达60~100%(比较的核酸长度均在200bp以上),约占62%;在这些cDNA序列中,有1个cDNA序列与己发表的来源于番木瓜的已知功能的基因序列同源性高达97%,还有两个序列与番木瓜未知功能的基因具有95%的同源率,其他的序列很大一部分也代表了与果实成熟基因有关。
本研究采用SSH和反向Northern点杂交相结合的方法对番木瓜采后果实中基因表达的变化进行了研究,获得了67个有明显表达差异的EST序列,初步分析了番木瓜采后成熟与品质形成的遗传学基础,并得到了一批未知的新基因片段,为克隆和鉴定新功能基因奠定了基础。