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研究背景:外伤、炎症、肿瘤切除及先天畸形造成的骨缺损是一类常见而复杂的疾病,严重影响患者生存质量。目前临床仍以自体骨移植作为骨缺损修复的金标准,但因供体缺乏,供区损伤而使临床应用受限。学者们试图寻找可以和自体骨的成骨性能相媲美的人工骨修复材料。理想的人工材料修复骨缺损过程是生物支架材料在体内逐渐降解吸收的同时种子细胞不断增殖分化,最终形成新的骨组织。传统方法中收获种子细胞时使用的胰蛋白酶会破坏种子细胞的细胞外基质及细胞间连接蛋白,影响细胞活性。接种到多孔支架材料中的一部分细胞会因未与支架材料贴附而流失。而新技术细胞膜片技术(cell sheet technology,CST)[1]可收获完整的细胞膜片,保留了细胞自分泌的细胞外基质以及一些重要的细胞表面蛋白如离子通道、生长因子受体等,并且减少了细胞流失。目前细胞膜片技术已成功应用于构建心肌、角膜、食管上皮、牙周韧带[2,3]等,但是在骨组织修复中的应用尚不明确。骨髓间充质干细胞(BMSCs)容易分离获取,有良好的自我更新及成骨分化潜力,是骨缺损修复的理想种子细胞。理想的支架材料应具有生物相容性、可降解性、骨传导性、骨诱导性,无免疫排斥反应,植入骨缺损处后可逐渐降解,最终被新生成的骨组织取代。Col-I是骨基质的主要成分,其疏松多孔结构有利于细胞的粘附植入,且具有成骨诱导作用,是理想的骨修复支架材料。研究目的:本研究通过细胞膜片技术构建出骨髓间充质干细胞膜片并复合Col-I支架制成生物材料人工骨,并与散在细胞复合支架构建的生物材料人工骨进行体外成骨分化能力的比较,探讨细胞膜片技术在骨缺损修复中的优势。研究方法:制备纳米级多孔Col-I支架,通过高密度连续培养及机械吹落的方法获得包含多层骨髓间充质干细胞的细胞膜片,将骨髓间充质干细胞膜片及散在骨髓间充质干细胞分别结合Col-I支架材料,培养于成骨诱导液,于不同时间点比较两者成骨分化标志物的表达,包括碱性磷酸酶(ALP)活性、骨桥蛋白(OPN)表达量以及钙结节的形成量,综合评价两者的成骨分化能力。研究结果:1.ALP活性:细胞结合支架后第3天和第7天,细胞膜片组(47.03±6.37U/L,22.61±1.95U/L)比散在细胞组(34.58±2.43U/L,16.28±104U/L)有更高的 ALP 活性(P<0.05)。2.OPN蛋白表达:细胞结合支架后第7、14、21、28天,细胞膜片组(1113.1±27.5ng/ml,966.5±95.2 ng/ml,1173.2±111.6 ng/rml,1157.6±47.4 ng/ml)比散在细胞组(943.5±18 ng/ml,735.8±101.7 ng/ml,1133.6±89.8 ng/ml,1077.2±137.6 ng/ml)有更大的OPN蛋白表达量(P<0.05)。3.钙结节形成量:细胞结合支架后第28天,扫描电镜可见细胞膜片组钙结节形成的密度明显高于散在细胞组。X射线能谱分析结果显示矿化结节主要由钙、磷、碳、氧四种元素构成,细胞膜片组钙元素含量(0.6%)明显高于散在细胞组(0.1%)。研究结论:BMSC膜片/Col-I支架构建的生物材料人工骨比BMSCs/Col-I支架构建的生物材料人工骨在体外有更强的成骨分化能力,细胞膜片技术在在骨缺损修复中有着潜在的应用价值。