【摘 要】
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研究目的:据报道,褪黑素可减少tau蛋白过度磷酸化、β-样淀粉蛋白（β-amyloid,Aβ）异常沉积等阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的病变,但其分子机制不明确。此外,许多研究团队和本课题组前期的研究证明,死亡相关蛋白激酶1（Death-associated protein kinase 1,DAPK1）在散发型AD的发生和发展中发挥着重要作用;且抑制DAPK1可降低
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研究目的:据报道,褪黑素可减少tau蛋白过度磷酸化、β-样淀粉蛋白（β-amyloid,Aβ）异常沉积等阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的病变,但其分子机制不明确。此外,许多研究团队和本课题组前期的研究证明,死亡相关蛋白激酶1（Death-associated protein kinase 1,DAPK1）在散发型AD的发生和发展中发挥着重要作用;且抑制DAPK1可降低tau蛋白的磷酸化水平、Aβ的分泌以及神经元的死亡,并改善AD小鼠的认知功能障碍。然而DAPK1的表达水平或其激酶活性是否受到上游调控因子的调控以及如何调控,目前仍未清楚。因此,本研究将探讨褪黑素调节DAPK1改善AD的分子机制,以及褪黑素和DAPK1抑制剂联合干预在AD发生和发展中的作用,为AD的治疗提供新方法。研究方法:1.采用褪黑素等吲哚类化合物处理人神经母细胞瘤细胞和小鼠原代皮层神经元,通过Western blot和q RT-PCR技术分别检测DAPK1的蛋白水平和m RNA水平,从而探索褪黑素是否以及如何调节DAPK1的表达。2.采用蛋白合成抑制剂放线菌酮和蛋白酶体抑制剂MG-132处理小鼠原代皮层神经元,通过Western blot技术检测DAPK1的蛋白水平,探索褪黑素是否以及如何降解DAPK1;采用Flag-DAPK1和His-ubiquitin质粒共转染至He La细胞,并使用褪黑素和MG-132进行干预,通过Western blot技术检测DAPK1的蛋白水平,探究褪黑素对DAPK1泛素化过程的影响。3.通过生物素-褪黑素竞争实验、pulldown实验和体外激酶实验,探究褪黑素与DAPK1的相互作用及其对DAPK1激酶活性的影响;并通过特异性褪黑素受体抑制剂的干预,探讨该相互作用是否依赖于褪黑素受体。4.采用褪黑素和DAPK1抑制剂对h Tau基因型小鼠脑切片和过表达GFP-Tau的SK-N-BE（2）细胞进行单独干预或联合干预,通过Western blot和免疫荧光技术,探究褪黑素和DAPK1抑制剂对tau蛋白磷酸化和生物学功能的影响。5.通过免疫组织化学技术检测正常人和AD患者脑组织中褪黑素和DAPK1的表达水平,探究AD患者中DAPK1和褪黑素表达水平的相关性。研究结果:1.褪黑素可显著降低内源性DAPK1的蛋白水平,且具有剂量和时间依赖性,而褪黑素对DAPK1的m RNA水平无明显影响;其他吲哚类化合物（血清素和色胺）对DAPK1的蛋白水平和m RNA水平均无明显影响。2.采用放线菌酮干预细胞后,结果发现,褪黑素降低DAPK1蛋白的稳定性,而MG-132对细胞干预可以逆转褪黑素对DAPK1蛋白稳定性的下调;并且泛素化实验证明,褪黑素能够促进DAPK1蛋白的泛素化。3.褪黑素能够与DAPK1蛋白的锚蛋白重复结构域相互作用,且不依赖于褪黑素受体;体外激酶实验结果显示,褪黑素与DAPK1的直接相互作用并不降低其活性。4.褪黑素和DAPK1抑制剂降低tau和Pin1-Ser71的磷酸化水平,以及促进神经元轴突生长和微管组装,并且褪黑素和DAPK1抑制剂联合干预,作用效果更加显著。5.与正常人相比,AD患者脑组织中DAPK1的表达水平显著升高,而褪黑素的表达水平显著降低。结论:褪黑素可直接靶向DAPK1,并通过促进泛素-蛋白酶体降解途径降低DAPK1蛋白稳定性,从而降低DAPK1介导的Pin1-Ser71磷酸化水平。此外,褪黑素与DAPK1抑制剂协同降低tau过度磷酸化以及促进神经元轴突生长和微管组装。因此,褪黑素和DAPK1抑制剂联合使用有望成为治疗AD的新型方法。
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