目的:心肌干细胞(cardiac stem cells,CSCs)移植治疗急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)的疗效受到存活率低和归巢细胞数量少的限制。基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)与其特异性受体趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)构成的SDF-1/CXCR4轴在CSCs迁移的过程中发挥重要作用;而PODXL(podocalyxin-likeprotein1,podocalyxin)是CSCs细胞膜上的一个表面标记,被证实在细胞粘附和细胞间相互作用中发挥重要作用。本研究在体外缺氧无血清条件下模拟心肌缺氧微环境,研究阿托伐他汀(atorvastatin,ATV)对小鼠CSCs的抗凋亡作用及可能发挥作用的分子机制。此外,本研究旨在探讨ATV预处理能否增加CSCs表面CXCR4和PODXL的表达,并提高其迁移能力及与内皮细胞的粘附、穿越作用,进而改善AMI后心功能。方法:首先,分离培养小鼠CSCs,在缺氧无血清条件下用ATV处理12小时,应用流式细胞术和Hoechst 33342荧光染色观察细胞凋亡,并利用Western blot方法检测通路蛋白AMPK、mTOR的磷酸化水平。其次,设置不同ATV浓度梯度组及时间梯度组,通过流式细胞术检测CSCs细胞表面CXCR4和PODXL的表达比例,确定ATV促进CSCs细胞表面CXCR4和PODXL表达的最佳浓度及时间。通过加入CXCR4的中和抗体及转染PODXL-siRNA阻断PODXL的表达进行机制研究,进行细胞迁移实验,细胞粘附实验和跨内皮迁移实验评价各组CSCs细胞迁移能力,与内皮细胞的粘附和穿越能力。最后,在体实验中将320只雌性C57小鼠随机分为sham组,AMI组,口服强化ATV组,移植CSCs组,移植ATV预处理的CSCs(ATV-CSCs)组,口服强化ATV联合移植ATV预处理的CSCs组(ATV+ATV-CSCs组),ATV预处理的转染si-PODXL的CSCs 组(ATV-PODXL-SiRNA-CSCs)组、ATV 预处理的转染 si-CXCR4 的 CSCs 组(ATV-CXCR4-SiRNA-CSCs)组。采用结扎冠状动脉前降支的方法制作急性心肌梗死模型,梗死后1周经颈静脉注射各组处理的CSCs(2×105细胞/只),对照组动物注射等体积PBS。在干细胞移植后3天(基线)及4周(终点)分别行心脏超声检测、病理组织学及分子生物学检测。结果:缺氧无血清条件引起明显的细胞凋亡,ATV处理组细胞凋亡率显著降低,且呈一定的浓度依赖性。ATV处理组AMPK磷酸化水平明显升高,加入AMPK阻断剂compound C可以显著阻断这种效应。ATV可以剂量依赖性促进CSCs表面CXCR4和PODXL的表达,在1μM ATV处理组和预处理12小时组表达比例最高。细胞迁移实验显示,加入CXCR4的中和抗体后CSCs的迁移能力明显下降,ATV促进CSCs迁移的作用也被显著抑制。细胞粘附实验发现,ATV可以提高CSCs的粘附能力,而阻断PODXL的表达,会显著降低CSCs与细胞外基质成分的粘附能力,同时也会明显抵消ATV促进CSCs细胞粘附的作用。在跨内皮迁移实验中,与CSCs组相比,ATV预处理CSCs组穿越内皮细胞层的细胞数量显著增加,而转染PODXL-siRNA的CSCs组细胞数量则显著减少。提示ATV促进CSCs与内皮细胞粘附及变形穿越内皮层的作用至少部分是通过PODXL蛋白介导的。在体实验中,口服强化ATV联合ATV预处理能够促进CSCs的存活及归巢,并从减轻炎症细胞浸润、抑制纤维化、减少心肌细胞凋亡及增加梗死周边区血管新生等多个方面促进心肌修复,进而减小心肌梗死面积,减轻心脏重塑,改善心功能。结论:本研究结果表明ATV具有显著的抗凋亡作用,可明显提高CSCs在缺氧无血清条件下的存活率,其作用可能与AMPK/mTOR通路有关。使用ATV预处理的CSCs进行细胞移植,可以通过提高CSCs细胞表面CXCR4和PODXL蛋白的表达地促进其归巢,改善AMI后心功能,联合口服强化ATV和ATV预处理的CSCs可以进一步提高CSCs移植的疗效,为提高干细胞移植疗效提供了一种新的可能思路。目的:急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)后局部心肌微环境恶劣,导致心肌细胞大量丢失,我们课题组的前期研究发现,他汀可以对缺氧无血清条件下内皮细胞及心肌细胞有保护作用。单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是调控细胞能量代谢的核心分子,它可以抑制下游哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)活性,在调节细胞凋亡和自噬中发挥重要作用。本研究拟应用Wistar大鼠冠脉结扎制作AMI模型,给予AMPK抑制剂compound C和ATV进行干预,对比观察他汀早期干预,对梗死后心肌微环境的影响,明确ATV对梗死周边区心肌细胞的凋亡和自噬的调节作用及相关通路。方法:将100只8周龄200-220gWistar大鼠随机平均分为5组:sham组,AMI组,口服强化ATV组(ATV组),口服强化ATV并注射compound C组(ATV+CC组),注射compound C组(CC组)。sham组手术线穿过前降支,但不结扎;其余各组开胸行前降支结扎,其中ATV(10mg/kg/d)和compound C(20mg/kg/w)从AMI模型制备当天开始给予至取材。为评价大鼠心功能的变化,我们在基线(AMI后3天)及终点(AMI后4周)时两次进行超声心动图检查来检测左室功能。此外,通过ELISA,病理学检测,Western blot等检测炎症因子水平,细胞凋亡,细胞自噬及通路蛋白的表达情况。结果:超声数据显示,与AMI组相比,口服ATV组的左室射血分数(LVEF)有明显提高;组织病理学检测显示,与AMI组相比,口服ATV组的左室纤维化面积和炎性细胞浸润明显改善,炎症因子表达水平降低;此外,口服ATV组凋亡细胞明显减少,自噬阳性细胞明显增加。加入AMPK抑制剂compound C后ATV的这些保护作用均被显著抑制。Western blot结果显示,口服ATV组p-AMPK的表达水平较其他几组明显上调,而p-p53和p-mTOR的水平则明显下调。使用AMPK抑制剂compound C后,ATV+CC组和CC组p-AMPK的表达水平均显著低于ATV组,与此相反的是,这两组p-p53和p-mTOR的表达水平则显著升高。而各组总AMPK,mTOR和p53的表达量却没有显著差异。由此可知,口服ATV可以促进AMPK磷酸化,提高p-AMPK/AMPK的比例,降低p-p53/p53和p-mTOR/mTOR的比例。而加入compound C后,ATV对p53和mTOR磷酸化的调节作用也被显著抑制。结论:本研究发现在大鼠急性心梗后4周,ATV可以通过AMPK/mTOR通路显著促进细胞自噬,抑制细胞凋亡;并且通过激活AMPK/mTOR通路,ATV可以促进心肌存活,减轻炎症反应,改善心功能。目的:在缺血再灌注损伤中,心脏微血管内皮细胞(cardiac microvascular endothelial cells,CMECs)通过微循环控制、旁分泌及近分泌、屏障保护三大功能在局部心肌组织中发挥保护作用。同时CMECs在缺血再灌注损伤时较心肌细胞更加敏感,更易受到损伤。通心络是一种由12种天然药材构成的中药复方制剂,具有保护内皮和防治心肌缺血再灌注损伤的功能。在本实验中,我们通过CMECs体外缺氧/复氧损伤模型和通心络处理,采取TMT(Tandem mass tag)标记的定量蛋白质谱方法检测内皮细胞中多种蛋白的变化以及通心络的调节作用,以便从整体水平系统研究缺氧/复氧损伤对于CMECs细胞内蛋白表达的影响以及通心络发挥调节作用的相关机制。方法:以不同浓度的通心络处理心脏微血管内皮细胞,缺氧2小时,复氧2小时,流式细胞术分析凋亡率以确定通心络作用的最佳浓度。通过TMT标记的蛋白质谱法检测心脏微血管内皮细胞在缺氧/复氧后细胞内发生变化的蛋白及通心络处理后变化的蛋白,并通过基因本体论分析及文献综述发生变化的蛋白的功能及参与的通路。为进一步验证差异蛋白功能,我们选取在缺氧/复氧和通心络干预下有显著变化的蛋白血红素加氧酶-1(heme oxygenase 1,HMOX1)和血管生成素-2(angiopoietin-2 isoform c precursor,ANGPT2),分别进行抑制和过表达,通过细胞迁移实验,成管实验,增殖实验等进行功能学验证。结果:通心络浓度依赖性地减少CMECs细胞凋亡,800μg/mL通心络的抗凋亡作用最明显。我们最终在三组中筛选出50个差异蛋白,并且进一步分析了这些蛋白的功能及通路。缺氧/复氧显著改变CMECs细胞内蛋白的表达,而通心络的干预会进一步改变细胞内蛋白的表达。与正常组相比,缺氧/复氧组下调了 30种蛋白的表达水平;而与缺氧/复氧组相比,通心络干预组上调了 6种蛋白的表达,下调了 5种蛋白的表达。这些差异蛋白的功能主要包括细胞增殖,应激反应,调节细胞内代谢等。我们选取了一些在缺氧/复氧条件下发挥重要作用的蛋白如HMOX1,ANGPT2等进行进一步分析。在缺氧/复氧条件下,通心络显著抑制CMECs细胞凋亡,促进CMECs细胞增殖,迁移和成管。当同时加入HMOX1抑制剂TiiPPIX或过表达ANGPT2时,细胞凋亡数量明显增加,发生增殖和迁移的细胞数量,成管长度及血管分支数均显著减少。结论:TMT标记蛋白质谱检测帮助我们从分子水平更深入的了解缺血再灌注损伤机制及通心络的调节作用。我们确定了 CMECs细胞内与缺血再灌注损伤相关的50个差异蛋白,并分析了它们可能参与的多种功能调节及通路。缺血再灌注会显著改变CMECs细胞内多种蛋白的表达,而通心络干预会进一步改变这些因子的水平,提示通心络可能通过下调炎症因子的表达,抑制氧化应激因子,调节多种细胞内代谢活动,发挥微血管内皮保护作用。