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脊柱结核作为严重危害人类健康的感染性疾病,其所导致的椎体骨质破坏会形成特异性感染性骨缺损,病灶清除术后骨缺损范围增大,形成了必须修复重建的结核感染性骨缺损。用于修复结核感染性骨缺损的材料缺乏以及病灶局部药物浓度不足使得脊柱结核治疗仍存在术后病灶迁延不愈和高复发率的问题。另外,全球范围内日益加重的耐药结核菌问题让修复结核感染性骨缺损变得愈加棘手。如何高效抗结核快速治愈病灶以及如何满意地修复结核感染性骨缺损、重建脊柱的稳定是脊柱外科亟待解决的难题。3D打印技术、局部药物缓释系统与新型抗结核药物的发展与结合为解决这一难题提供了新的思路。目的1.应用3D打印构建负载新三联抗结核药物普托马尼（Pretomanid,Pa）、莫西沙星（Moxifloxacin,M）、吡嗪酰胺（Pyrazinamide,Z）组合（Pa Mz）和骨形态发生蛋白-2（Bone morphogenetic prtein 2,BMP-2）的纳米羟基磷灰石（nano-Hydroxyapatite,n HA）抗结核人工骨,并评估其力学性能及缓释药物性能。2.通过体外实验评价3D打印载Pa MZ/BMP-2的n HA人工骨的成骨及抗结核性能。3.建立动物模型,明确3D打印载Pa MZ/BMP-2的n HA人工骨在体内的生物安全性及骨缺损修复能力,明确其在体内的药物缓释情况,间接评价其体内的抗结核性能。方法1.采用复乳溶剂挥发法制备BMP-2/PLGA微球,测定其包封率;按优选比例制备Pa MZ-PLGA固体分散体溶液,将其与BMP-2/PLGA微球加入n HA打印墨水后采用3D打印构建载Pa MZ/BMP-2的n HA人工骨,扫描电镜观察其表征;电子万能材料试验机测试其抗压缩性能;分别采用高效液相色谱法和ELISA法测定三种抗结核药和BMP-2的体外释放情况。2.采集新西兰兔间充质干细胞（BMSCs）,全骨髓贴壁法,流式细胞技术和多向诱导分化对其进行培养鉴定;将其与载Pa MZ/BMP-2的n HA人工骨共培养,扫描电镜观察其在支架上的黏附能力;CCK8法检测支架对BMSCs增殖的影响;对共培养细胞行碱性磷酸酶活性检测、茜素红染色,并分别采用RT-q PCR和Western Blot检测成骨因子RNNX-2、COL-Ⅰ的m RNA和蛋白表达水平评价人工骨体外成骨性能;将人工骨分别与敏感和耐药结核分枝杆菌共培养,采用时间杀菌实验评价其早期抗结核性能;用人工骨释药实验终末的浸提液制备含药培养基分别培养敏感和耐药结核分枝杆菌评价其在释放84天时的抗结核性能。3.建立新西兰兔脊柱骨缺损模型,植入载Pa MZ/BMP-2的n HA人工骨,设置对照组,通过对动物一般情况观察、体温、体重监测、肝肾功能检测评价人工骨的生物安全性;通过术后4、8、12周的螺旋CT三维重建观察骨缺损修复情况;通过对术后8、12周的组织大体观察及HE染色评价其体内成骨性能;建立SD大鼠模型,植入载Pa MZ/BMP-2的n HA人工骨,采用高效液相色谱法分别检测材料周围肌肉组织和血浆中不同时间点的药物浓度,明确其体内释药规律及分布,间接评价其体内的抗结核性能。结果1.复乳溶剂挥发法制备的BMP-2/PLGA微球为表面多孔略粗糙的球形,分散性良好,大小形态均匀,平均直径为75.09±34.28μm,平均包封率为（45.81±2.47）%;3D打印构建的载Pa MZ/BMP-2的n HA人工骨其n HA/PLGA质量占比为（61/30）%,孔隙率60%,孔径200μm,电镜下表面粗糙,结构均匀,力学测试其抗压缩强度为4.82±0.29Mpa;其负载的Pa、M和Z在体外表现出良好的缓释性能,至84天时累积释放率分别为（71.0±0.71）%、（96.01±1.54）%和（96.39±2.22）%,峰浓度分别为73.49±2.33μg/m L、331.85±19.56μg/m L和1556.17±68.43μg/m L;BMP-2可在体外持续释放28天,累积释放率为（91.02±3.25）%,峰浓度为0.13±0.02μg/m L。2.流式细胞技术和多向诱导分化鉴定所培养的兔BMSCs符合干细胞鉴定标准;BMSCs与载Pa MZ/BMP-2的n HA人工骨共培养时可在支架表面黏附并增殖,CCK8法检测显示共培养14天后实验组细胞增殖活性与阳性对照组无统计学差异（P＞0.05）,明显优于空白对照组（P＜0.01）;ALP活性检测显示实验组和阳性对照组在各时间点无统计学差异（P＞0.05）,但均明显优于空白对照组（P＜0.01）;茜素红染色显示实验组矿化物质分布最为密集,体积更大且更致密;RT-q PCR检测实验组和阳性对照组在各时间点的RUNX-2和COL-Ⅰm RNA表达无统计学差异（P＞0.05）,但均明显优于空白对照组（P＜0.01）;Western Blot检测实验组和阳性对照组在第14天和21天时RUNX-2和COL-Ⅰ的蛋白相对表达量无统计学差异（P＞0.05）,但均明显优于空白对照组（P＜0.01）。时间杀菌实验表明载药人工骨无论对敏感的H37Rv菌株还是对临床分离的耐利福平的结核菌株都具有明显的杀菌能力,植入3天后开始表现出明显的抑菌性能,在植入10天后已能彻底抑制结核杆菌的生长和繁殖;以载药人工骨释药实验终末的浸提液制备载药培养基培养结果杆菌结果显示载药人工骨在释药84天后对敏感的H37Rv菌株表现出与传统抗结核药物利福平一致的杀菌性能,对临床分离的耐利福平的结核菌株也表现出明显的抑制作用。3.所有兔脊柱骨缺损模型构建成功,无切口感染、死亡等情况发生,实验组动物的体温、体重及肝肾功能指标正常,与各对照组均无统计学差异（P＞0.05）;术后4、8、12周的螺旋CT重建结果提示各组植入物无松动及脱落表现,至12周时,植入载Pa MZ/BMP-2的n HA人工骨的A组、未载药人工骨的B组、自体髂骨的C组均达到骨性融合,空白不植骨D组骨缺损无明显愈合迹象,CT-Hedberg评分结果显示在术后4周时,A组与C组相比无统计学差异（P＞0.05）外,其余各组间相比均有统计学差异（P＜0.05）;术后8周时,A组与C组、B组与C组相比无统计学差异（P＞0.05）,但A组与B组相比仍有统计学差异（P＜0.05）;术后12周时,A、B、C三组间相比无统计学差异（P＞0.05）,但均与D组有统计学差异（P＜0.05）;术后8周对大体标本的观察显示,A、B两组均发现有少量人工骨裸露在外的情况,但A组形成的骨痂更多,而B组人工骨裸露在外的情况较A组更为明显,至12周时A组人工骨完全被新骨包埋,但B组仍有部分人工骨裸露未被新骨包裹或替代,新骨以沿人工骨表面爬行和包绕的方式生长;HE染色结果显示在术后8周时,A组和C组可见大量的新骨形成,主要为软骨细胞向成骨细胞分化的软骨内成骨,B组在人工骨周围也有少量新骨形成,但未见软骨内成骨的表现,D组无新骨形成;至第12周,A组形成的新骨组织与支架材料交错分布,在人工骨的孔隙内可见新骨形成,也可见到人工骨被新骨包裹替代,B组形成的新骨较前增多,但大部分分布在人工骨的表面,C组仍可见软骨内成骨的发生,可以清晰的见到髂骨植骨界面的融合,D组的骨缺损界面在纤维组织包裹下也形成了少量的新骨;对植入物-骨缺损界面的骨小梁总面积定量分析显示在术后8周和12周时,A组和C组相比无统计学差异（P＞0.05）,其余各组间相比均有统计学差异（P＜0.05）。所有SD大鼠动物模型构建成功,无切口感染、死亡等情况发生,高效液相色谱法检测Pa、M、Z三种药物在SD大鼠体内不同时间点的局部组织药物浓度和血浆药物浓度结果显示三种药物在体内均能良好缓释,局部组织药物浓度时间曲线的趋势与体外释药实验相一致,Pa、M、Z的峰浓度分别出现在给药后第28天、14天和第7天;血药浓度在植入载药人工骨后的初始时间点未测出,随后测得结果远低于局部组织药物浓度,二者具有正相关关系,三药的回归方程拟合优度R~2分别为:0.7455、0.8984和0.9109。结论1.本研究成功构建了3D打印载PaMZ/BMP-2的n HA人工骨,其力学性能与人体松质骨抗压缩强度相匹配,具有良好的药物缓释性能,对敏感结核菌和耐利福平的耐药结核菌均有效。2.该人工骨在体外无细胞毒性,在体内无肝肾毒性,具有良好的成骨和抗结核性能,为临床修复结核感染性骨缺损提供了新的思路。