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硝基呋喃类兽药是一类人工合成的广谱抗菌药,用于预防和治疗由大肠杆菌和沙门氏菌引起的胃肠道感染,这类药物进入动物体后会很快代谢为相应的代谢物,并在动物体内长期稳定存在。由于该类药物及其代谢物会对人体产生潜在的致癌、致突变作用,很多国家禁止用于食品生产的动物使用此类药物。但是此类抗生素成本低、预防和治疗细菌感染效果明显,因此仍然被非法使用。呋喃西林是硝基呋喃类兽药中的一种。目前检测呋喃西林代谢物(SEM)的方法主要是仪器分析法,这类方法虽然准确度和精密度高、重复性好,且可同时检测多种物质,但是检测时间长、成本高、操作技术要求高,不适于现场快速检测及大量样品的筛查。与之相比,酶免疫分析法则技术要求不高,可实现大批量样品的快速筛查,且其准确度和精密度均较高、特异性较强。因此,本研究建立了三种检测SEM的酶免疫分析法,包括化学发光酶免疫法(CLEIA)、生物素-亲和素放大酶免疫法(BA-ELISA)和酶联免疫吸附法(ELISA)。首先,分别用对醛基苯甲酸(4-CBA)和邻硝基苯甲醛(2-NPA)对SEM进行衍生,合成了半抗原CPSEM和目标检测物NPSEM,并用红外光谱和核磁共振对产物进行了鉴定。采用活化酯法将CPSEM与卵清蛋白(OVA)偶联制备获得了人工抗原CPSEM-OVA,并用紫外扫谱法进行了鉴定。其次,对酶免疫分析操作中的主要影响条件进行了优化。优化得到的化学发光液配方为:A液为8mM对碘苯酚溶液和10mM鲁米诺溶液按体积比1:1混匀,B液为每10mL Tris-HCl缓冲溶液中加5μL 30%H2O2溶液;临用前将A液和B液按体积比1:1混匀。CLEIA最佳反应条件为包被原800倍稀释,单抗800倍稀释,封闭液为1%脱脂乳,竞争反应30min,HRP-IgG孵育60min。BA-ELISA最佳反应条件为包被原800倍稀释,单抗12800倍稀释,SA-HRP 8000倍稀释,封闭液为1%脱脂乳,竞争反应 30min,Biotin-IgG 孵育 30min,SA-HRP 孵育 60min,显色 15min。ELISA最佳反应条件为包被原800倍稀释,单抗6400倍稀释,封闭液为0.5%脱脂乳,竞争反应 30min,HRP-IgG 孵育 30min,显色 15min。最后,在已优化的最优条件下对建立的3种酶免疫分析方法进行了对比评价。3种方法与其他结构类似物以及所用衍生化试剂的交叉反应率(cross reactivity,CR)均小于0.1%。CLEIA线性方程为y=-0.4654x+0.3768(R2=0.993),IC50为0.544ng/mL,线性范围为0.123～2.398ng/mL;批内和批间变异系数(Coefficient of Variation,CV)分别为1.9%～4.1%和2.8%～5.3%;回收率为89.6%～98.0%,CV为3.0%～9.5%。BA-ELISA线性方程为y=-0.3299+0.4272(R2=0.990),IC50为0.601ng/mL,线性范围为0.074～4.883ng/mL;批内和批间CV分别为1.2%～3.6%和2.5%～5.1%;回收率为88.8%～98.5%,CV为3.7%～5.6%。ELISA线性方程为y=-0.4262x+0.6926,IC50为2.831ng/mL,线性范围为0.560～14.315ng/mL;批内和批间CV分别为1.8%～5.1%和3.4%～6.3%;回收率为87.9%～94.1%,CV为4.2%～8.9%。结果表明,本研究建立的检测SEM残留的三种方法虽然在灵敏度、精密度和准确度方面存在一定差异,各有优缺点,准确度方面比HPLC-MS/MS法稍差,但是均能满足实际样品检测的需求,可用于动物组织中SEM的快速筛查,也为下一步研制SEM快检试剂盒奠定了基础。