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目的: 1.分析类风湿关节炎(RA)患者肠道特异菌属的菌群结构,探讨RA肠道特异菌属多样性变化和菌群特征,为筛选对RA有调整作用的益生菌候选菌株提供依据。 2.探讨肠道菌群紊乱对大鼠类风湿关节炎发生发展的影响。 3.探讨罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)的调整对大鼠类风湿关节炎发生发展的影响及机制。 方法: 1.根据临床诊断标准筛选出RA患者,采取粪便标本。 2.利用PCR-DGGE指纹图谱技术分析RA组肠道特异菌属多样性的变化,利用切胶测序的方法分析特异性条带种属类别。 3.利用特异性引物PCR扩增鉴定RA组和正常组特异性菌种。 4.利用Ⅱ型胶原蛋白和非完全弗氏佐剂两次免疫的方法建立大鼠类风湿关节炎模型。 5.利用抗生素头孢曲松钠灌胃的方法建立大鼠肠道菌群失衡模型。 6.利用罗伊氏乳杆菌、两歧双歧杆菌灌胃的方法建立大鼠肠道菌群重建模型。 7.利用PCR-DGGE指纹图谱技术分析各组大鼠各个阶段肠道菌群变化。 8.利用关节肿胀评分,评估关节肿胀程度。 9.利用酶联免疫吸附(ELISA)方法测定免疫指标IgG、IL1-β、TNF-α、IL-6、IL-17、IL-4和IL-10的含量。 10.利用比色法测定SOD活力和MDA含量。 结果: RA患者肠道特异菌属变化分析 1.与正常组相比,RA组中的乳杆菌属多样性明显降低(p<0.01),测序与PCR鉴定显示RA组罗伊氏乳杆菌(p<0.01)和唾液乳杆菌(p<0.05)明显降低,融合魏斯氏菌明显增多(p<0.05),惰性乳杆菌有增多趋势。 2.与正常组相比,RA组中的类杆菌属多样性明显降低(p<0.01)。切胶测序结果显示,正常组较多的菌种为粪便拟杆菌(Bacteroides stercoris);RA组较多的菌种为多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)。 3.与正常组相比,RA组中的普雷沃菌属多样性明显降低(p<0.01)。 肠道菌群紊乱和成模前调整对大鼠类风湿关节炎的影响及机制研究 1.与对照组相比,抗生素组肠道菌群多样性降低(p<0.01)。 2.与对照组相比,模型组条带数有所减少,菌群调节后有升高趋势;与模型组相比,抗生素处理结束42天后的模型组条带数无明显差异,菌群调整后条带数有所增加。 3.与对照组相比,模型组关节肿胀评分和血清中IgG含量明显升高(p<0.01),罗伊氏乳杆菌调整后关节肿胀评分明显降低(p<0.05),IgG有降低趋势,菌群调整后略有降低。 4.与对照组相比,模型组血清中IL1-β、TNF-α、IL-17(p<0.01)和IL-6(p<0.05)含量明显升高,IL-4和IL-10的含量明显降低(p<0.01),罗伊氏乳杆菌调整后IL1-β、TNF-α和IL-17明显降低(p<0.01),IL-6略有降低,IL-4含量明显回升(p<0.01),IL-10略有升高,两歧双歧杆菌调整后IL1-β和TNF-α明显降低(p<0.01),IL-6和IL-17有降低趋势;IL-4含量明显回升(p<0.05),IL-10略有升高。 5.与模型组相比,罗伊氏乳杆菌调整组血清和滑膜液中SOD活力略有升高,血清中MDA含量明显降低(p<0.05),两歧双歧杆菌调整组血清中的SOD活力略有升高,滑膜液中的SOD活力明显升高(p<0.05),血清中MDA含量降低。 6.以上所有指标,与模型组相比,抗生素处理后模型组除了IL1-β(p<0.01)其余指标均无明显差异。 肠道菌群紊乱及成模后调整对大鼠类风湿关节炎的影响及机制研究 1.与对照组相比,模型组条带数有所减少,菌群调节后有恢复趋势;与模型组相比,抗生素处理结束42天后的模型组条带数无明显差异,菌群调整后条带数有所增加。 2.与对照组相比,模型组关节肿胀评分和血清中IgG含量明显升高(p<0.01),罗伊氏乳杆菌和两歧双歧杆菌调整后肿胀评分有降低趋势,IgG明显降低(p<0.01,p<0.05)。 3.与对照组相比,模型组血清中IL1-β、IL-6、IL-17(p<0.01)和TNF-α(p<0.05)的含量明显升高,IL-4和IL-10的含量明显降低(p<0.01),罗伊氏乳杆菌调整后IL1-β、IL-6、IL-17(p<0.01)和TNF-α(p<0.05)明显降低,IL-4略有升高,IL-10含量明显回升(p<0.05),两歧双歧杆菌调整后IL1-β、IL-6、IL-17(p<0.01)和TNF-α(p<0.05)明显降低,IL-4和IL-10略有升高。 4.与模型组相比,罗伊氏乳杆菌调整组血清和滑膜液中的SOD活力略有升高,血清中MDA含量明显降低(p<0.01),两歧双歧杆菌调整后血清中SOD活力明显升高(p<0.01),滑膜液中的SOD活力略有升高(p<0.05),血清中MDA含量明显降低(p<0.05)。 5.以下所有指标,与模型组相比,抗生素处理后模型组的结果均无明显差异。 结论: 1.RA患者中乳杆菌属、类杆菌属和普雷沃菌属多样性明显降低。 2.成年期大鼠—过性菌群紊乱对RA发生发展影响不明显。 3.建模前给予罗伊氏乳杆菌、两歧双歧杆菌能够减轻RA肿胀程度,延缓RA发生发展,此作用可能通过减缓炎症和降低氧化压力起效。 4.建模后给予罗伊氏乳杆菌、两歧双歧杆菌能够减缓炎症和降低氧化压力,从而出现减轻关节肿胀、延缓RA发展的趋势。