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目的:通过免疫组织化学法和real-time PCR法检测结直肠正常粘膜组织、腺瘤组织、腺癌组织中SGLT-1、EGFR和HER-2蛋白及mRNA的表达水平,分析其表达与结直肠癌各项临床病理参数的关系以及三者表达的相关性,为探讨结直肠癌的发生发展机制以及基因诊断、治疗、判断预后提供更多的实验数据及理论基础。
方法:
1.免疫组化法检测SGLT-1、EGFR和HER-2蛋白在结直肠粘膜腺瘤及腺癌中的表达
1.1收集唐山市工人医院2009年10月-2011年10月手术切除的结直肠腺癌及腺瘤标本制作的蜡块,同时选取对应的结直肠癌切缘粘膜组织作为正常粘膜。所有病例术前未经任何放化疗和抗肿瘤治疗。将研究对象分为三组:正常粘膜组、腺瘤组和腺癌组。其中腺癌组251例,腺瘤组80例,正常粘膜组167例。结直肠癌患者中男性158例,女性93例,男女比例1.7:1,年龄31-89岁,平均62.0±11.1岁。腺瘤组中,共80例。男性51例,女性29例,男女比例1.8:1,年龄5-89岁,平均59.3±14.5岁。正常粘膜组共167例,男性105例,女性62例,男女比例1.7:1,年龄33-88岁,平均60.2±10.1岁。所有病例的病理诊断均经有经验的两名副主任医师进行复诊,包括组织学类型、分级、淋巴结转移情况等。其临床及病理存档资料分别来自病理科和病案室,资料不完整者已去除。
1.2组织芯片的制作收集三组病例的HE染色切片,镜下确定检测区,用12＃、16＃骨髓穿刺针进行打孔和穿取组织,制作组织芯片。
1.3用免疫组织化学(S-P)法检测SGLT-1、EGFR和HER-2蛋白的表达情况,并分析三种蛋白的表达与结直肠癌各项临床病理参数的关系及三者表达的相关性。
2. real-time PCR检测SGLT-1、EGFR和HER-2 mRNA在结直肠正常粘膜及腺癌组织中的表达
2.1收集唐山工人医院2008年结直肠癌新鲜标本35例,其中男性20例,女性15例,年龄为31-82岁,平均64.7±12.3岁。35例标本均带有切缘粘膜组织,随机筛选10例切缘粘膜组织作为正常对照组。采用real-timePCR.法检测SGLT-1、EGFR和HER-2 mRNA在结直肠正常粘膜及腺癌组织中的表达情况。
3.统计学方法
实验中所有数据结果均用SPSS13.0软件进行统计分析,定性资料采用X2检验,定量资料采用t检验或者F分析,采用spearman进行相关性研究,以P＜0.05为差异有统计学意义。
结果:
1. SGLT-1蛋白及mRNA在结直肠正常粘膜组、腺瘤组和腺癌组中的表达
SGLT-1蛋白在正常粘膜组中表达的阳性率为13.8％(23/167),在腺瘤组中表达的阳性率为26.3%(21/80),在腺癌组中表达的阳性率为60.6%(152/251),经统计学分析,SGLT-1蛋白在腺癌中表达的阳性率明显高于腺瘤组(P＜0.001)和正常粘膜组(P＜0.001),腺瘤组中的表达阳性率高于正常粘膜组(P＜0.05)。
SGLT-1 mRNA在正常粘膜组中的相对比值分别为0.0072±0.004,在肿瘤组中的相对比值分别为0.0424±0.04956,经统计学分析,二组差别有显著性意义(P＜0.05),即SGLT-1 mRNA在肿瘤组中的表达量明显高于其在正常粘膜组中的表达。
2. SGLT-1蛋白及mRNA在结直肠癌组织中的表达与其临床病理特征的关系
SGLT-1在高、中分化的结直肠癌中表达的阳性率为56.4%(115/204),在低分化的结直肠癌中表达的阳性率为78.7%(37/47),经统计学分析,两组差别有显著性意义(P＜0.05);SGLT-1在Ⅰ+Ⅱ期的结直肠癌中表达的阳性率为46.2%(78/149),在Ⅲ+Ⅳ期的结直肠癌中表达的阳性率为90.2%(74/82),经统计学分析,两组差别有显著性意义(P＜0.001),即SGLT-1在低分化的结直肠癌中表达的阳性率明显高于高、中分化的结直肠癌、在Ⅲ+Ⅳ期的结直肠癌中表达的阳性率明显高于Ⅰ+Ⅱ期的结直肠癌。而SGLT-1在不同性别、年龄、肿瘤最大径、淋巴结转移的结直肠癌中的阳性表达差别无显著性意义(P＞0.05)。
肿瘤组中SGLT-1mRNA.在不同性别、年龄、组织分型、分化程度中的表达量差别均无显著性意义(P＞0.05)。
3. EGFR蛋白及mRNA在结直肠正常粘膜组、腺瘤组和腺癌组中的表达
EGFR蛋白在正常粘膜组中表达的阳性率为21%(35/167),在腺瘤组中表达的阳性率为42.5%(34/80),在腺癌组中表达的阳性率65.7%(165/251),经统计学分析,三组中阳性率的表达差别有统计学意义(P＜0.001),EGFR在腺癌组中表达的阳性率明显高于其他组别(P＜0.001),腺瘤组高于正常粘膜组(P＜0.001)。
EGFR mRNA在正常组中的相对比值分别为0.0023±0.00153,在肿瘤组中的相对比值分别为0.0046±0.00277,经统计学分析,二组差别有统计学意义(P＜0.05),即EGFR mRNA在肿瘤组中的表达量明显高于正常组。
4. EGFR蛋白以及tuRNA在结直肠癌组织中的表达与其临床病理特征的关系
EGFR.蛋白在无淋巴结转移的结直肠癌中表达的阳性率为60.8%(101/166),在有淋巴结转移的结直肠癌中表达的阳性率为75.3%(64/85),经统计学分析,两组差别有显著性意义(P＜0.05)。EGFR在Ⅰ+Ⅱ期的结直肠癌中表达的阳性率为52.1%(88/169),在Ⅲ-Ⅳ期的结直肠癌中表达的阳性率为93.9%(77/82),经统计学分析,两组差别有显著性意义(P＜0.001)。EGFR.的阳性表达率在不同性别、年龄、肿瘤最大径、分化程度的结直肠癌中差别无显著性意义(P＞0.05)。
肿瘤组中EGFR mRNA在不同性别、年龄、组织分型、分化程度以及淋巴结转移中的表达量差别均无显著性意义(P＞0.05)。
5. HER-2蛋白以及mRNA在结直肠正常粘膜组、腺瘤组和腺癌组中的表达
HER-2蛋白在正常粘膜组中表达的阳性率为19.2%(32/167),在腺瘤组中表达的阳性率为43.8%(35/80),在腺癌组中表达的阳性率为70.9%(178/251),经统计学分析,三组中阳性率的表达差别有显著性意义(P＜0.001),即HER-2表达的阳性率在腺癌组中明显高于其他组别,在腺瘤组明显高于正常粘膜组。
HER-2 mRNA在正常组中的相对比值分别为0.0008±0.00077,在肿瘤组中的相对比值分别为0.0034±0.00923,经统计学分析,二组差别有显著性意义(P＜0.05),即在肿瘤组中的表达量明显高于正常组。
6. HER-2蛋白在结直肠癌组织中的表达与其临床病理特征的关系
HER-2蛋白在Ⅰ+Ⅱ期的结直肠癌中表达的阳性率为61.5%(104/169),在Ⅲ-Ⅳ期的结直肠癌中表达的阳性率为90.2%(74/82),经统计学分析,两组差别有显著性意义(P＜0.001);HER-2在高、中分化的结直肠癌中表达的阳性率为68.1%(139/204),在低分化的结直肠癌中表达的阳性率为83%(39/47),两组差别有显著性意义(P＜0.05);在无淋巴结转移的结直肠癌中表达的阳性率为65.1%(108/166),在有淋巴结转移的结直肠癌中表达的阳性率为82.4%(70/85),经统计学分析,两组差别有统计学意义(P＜0.05)。HER-2的阳性表达率在不同性别、年龄的结直肠癌中差别无显著性意义(P＞0.05)。
肿瘤组中HER-2 mRNA在无淋巴结转移的结直肠癌中的表达量为0.00074±0.000474,在有淋巴结转移的结直肠癌中的表达量为0.00588±0.01251,经统计学分析,二组差别有显著性意义(P＜0.01),即HER-2 mRNA在有淋巴结转移组中的表达量明显高于无淋巴结转移组。在不同性别、年龄、组织分型、分化程度中的表达量均无显著性差别(P＞0.05)。
7.结直肠癌中SGLT-1、EGFR和HER-2三者的相关性研究
结直肠癌组中SGLT-1 mRNA和HER-2 mRNA的表达呈正相关(r=0.416,p=0.016),SGLT-1 tuRNA和EGFR mRNA,EGFR mRNA和HER-2 mRNA的表达无相关性(r=0.306,P=0.079;r=0.287,P=0.100)。
结论:
1.结直肠癌中SGLT-1、EGFR、HER-2蛋白及mRNA表达量明显高于腺瘤和正常粘膜组织,三者的表达增高可能与结直肠癌的早期发生有关;
2. SGLT-1、EGFR、HER-2的高表达同结直肠癌的进展有关;
3.结直肠癌中SGI-1和HER-2的表达呈正相关,表明二者在结直肠癌发生发展过程中可能存在协同作用;
4.联合对结直肠癌组织进行SGLT-1、EGFR和HER-2蛋白及mENA的检测,有助于对结直肠癌的发生及生物学行为判断。