【摘 要】
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背景:NLRP6是NOD样受体家族中的成员之一,主要表达于大肠、小肠、肝及肾组织中,能够识别病原相关分子模式与损伤相关分子模式,参与机体的免疫炎症反应。NLRP6最初在体外实验中被发现与ASC共表达,导致caspase-1及NF-κB的激活;随后在一系列的肠道疾病研究中,发现其受到配体刺激后能与ASC、caspase-1组装成炎性小体,介导下游炎症因子的成熟与释放,调节肠道炎症,维持肠道微生物环境
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背景:NLRP6是NOD样受体家族中的成员之一,主要表达于大肠、小肠、肝及肾组织中,能够识别病原相关分子模式与损伤相关分子模式,参与机体的免疫炎症反应。NLRP6最初在体外实验中被发现与ASC共表达,导致caspase-1及NF-κB的激活;随后在一系列的肠道疾病研究中,发现其受到配体刺激后能与ASC、caspase-1组装成炎性小体,介导下游炎症因子的成熟与释放,调节肠道炎症,维持肠道微生物环境的稳态。然而,在另外一些炎症性疾病如牙周炎、肝炎中,NLRP6又被证明可以非炎性小体依赖的形式,通过抑制NF-κB信号通路来发挥抗炎作用。因此,不同的激活机制可能导致了NLRP6对下游炎症反应的不同调控过程。泛素化修饰对蛋白质的定位、结构、功能和降解都起着十分重要的作用,已有研究表明,同家族中NLRP3炎性小体的激活受到去泛素化机制的严格调控,但有关NLRP6的泛素化修饰以及这种修饰对下游炎症因子的影响目前仍鲜有报道。目的:探讨NLRP6潜在的泛素化修饰位点,以及该位点对下游效应分子caspase-1、IL-1β的影响。方法:（1）通过共转染Flag-NLRP6与HA-Ub于293T细胞,使用免疫沉淀及Western Blot的方法,检测NLRP6是否存在泛素化修饰。（2）利用多序列比对及在线软件预测分析,推测NLRP6潜在的保守泛素化赖氨酸残基。通过定点突变,将相应的赖氨酸（K）位点突变为精氨酸（R）,鉴定NLRP6发生泛素化修饰的关键赖氨酸位点。（3）在293T细胞中,通过共转染NLRP6炎性小体各组分,包括Flag-NLRP6、ASC、His-caspase-1、Flag-IL-1β,建立体外的NLRP6炎性小体体系,使用Western Blot的方法检测NLRP6对下游caspase-1及IL-1β剪切的影响。（4）构建野生型NLRP6炎性小体体系与泛素化位点突变的NLRP6炎性小体体系,使用Western Blot及Co-IP的方法检测该赖氨酸位点对caspase-1及IL-1β剪切的影响及机制。结果:（1）Flag-NLRP6与HA-Ub共转后显示NLRP6存在泛素化修饰。（2）通过软件预测及多序列比对,推测K411、K682、K684、K687为可能的保守泛素化位点,分别进行定点突变后,鉴定出K411可能是NLRP6发生泛素化的关键位点。（3）在293T细胞中成功构建出NLRP6炎性小体体系,证实NLRP6参与了caspase-1及IL-1β的剪切,探索出各成分之间的剂量关系。（4）将Flag-NLRP6-WT与Flag-NLRP6-K411R分别与炎性小体各组分共转染,发现K411R突变体与ASC结合能力减弱,不能有效促进caspase-1及IL-1β的剪切。结论:NLRP6的K411位点的泛素化修饰有助于其与ASC的结合,促进炎性小体的活化,引起caspase-1及IL-1β的剪切与成熟。
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