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镰刀菌毒素玉米赤霉烯酮（ZEA）和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）是污染我国粮食和饲料原料的主要霉菌毒素,二者对动物机体均有潜在的免疫毒性作用。单核细胞增多性李斯特菌（Lm）同样是环境中广泛存在的食源性病原微生物,而肝细胞的免疫功能是抵抗李斯特菌感染并阻止细菌全身性扩散的关键,其能识别李斯特菌并招募吞噬细胞以及自身表达天然抗菌产物一氧化氮参与抗菌反应。目前国内外对ZEA和DON的联合免疫毒性效应及二者对机体抵抗病原体感染的影响相关研究较少。本研究通过体外细胞试验结合体内动物试验,探究了 ZEA、DON及联合对肝细胞介导的抗李斯特菌感染的影响及机制。1.ZEA、DON及联合对肝细胞TLR2及MyD88表达的影响采用不同浓度 ZEA（1、2、5、10、20、40μmol/L）、DON（0.1、0.2、0.5、1、2、4 μmol/L）及 ZEA+DON（10 μmol/L ZEA+1μmol/L DON、20 μmol/LZEA+2 μmol/L DON）作用于体外培养的BRL 3A肝细胞,24 h后,CCK-8法检测细胞相对活率;设立对照组、ZEA（10、20 μmol/L）组、DON（1、2μmol/L）组、ZEA+DON（10μmol/L ZEA、1μmol/L DON）组,染毒 24 h 后,qRT-PCR 检测 TLR2、MyD88 基因表达,Western Blot检测TLR2、MyD88蛋白表达。结果显示,与对照组相比,随着染毒剂量增加,不同浓度ZEA、DON及ZEA+DON组细胞活率出现显著或极显著下降（P＜0.05或P＜0.01）;与不同浓度ZEA组相比,20μmol/LZEA+2μmol/L DON组细胞活率显著下降（P＜0.05）;与不同浓度DON组相比,不同浓度ZEA+DON组细胞活率均无显著差异（P＞0.05）。与对照组相比,不同浓度ZEA、DON组及ZEA+DON组TLR2、MyD88基因及蛋白表达均显著或极显著下降（P＜0.05或P＜0.01）;与10 μmol/L ZEA组相比,ZEA+DON组TLR2、MyD88基因及蛋白表达显著或极显著下降（P＜0.05或P＜0.01）;与1μmol/LDON组相比,ZEA+DON组TLR2、MyD88基因及蛋白表达均无显著差异（P＞0.05）。以上结果表明,ZEA、DON及联合均能抑制肝细胞TLR2、MyD88基因及蛋白表达,但毒素联合不呈现协同作用。2.ZEA、DON及联合对LTA诱导肝细胞免疫应答的影响以体外培养的BRL3A肝细胞为材料,设立对照组、LTA（2μg/mL）组、LTA（2μg/mL）+ZEA（10、20 μmol/L）组、LTA（2μg/mL）+DON（1、2μmol/L）组、LTA（2μg/mL）+ZEA+DON（10μmol/LZEA、1μmol/L DON）组,24 h 后,qRT-PCR 及Transwell分别检测肝细胞内趋化因子MCP-1、CCL7、CCL12的表达及其对单核巨噬细胞的趋化作用,流式细胞术及Western Blot检测肝细胞NO含量及NOS2蛋白表达,qRT-PCR 检测 TLR2、MyD88 基因表达,Western Blot 检测 TLR2、MyD88 及 TLR2/NFκB通路相关蛋白表达,免疫荧光检测NFκB核转位。结果显示,与对照组相比,LTA组趋化因子表达、迁移至下室的单核巨噬细胞数、NO含量及NOS2蛋白表达均极显著上升（P＜0.01）;与LTA组相比,不同浓度ZEA、DON组及ZEA+DON组趋化因子表达、迁移至下室的单核巨噬细胞数、NO含量及NOS2蛋白表达均显著或极显著下降（P＜0.05或P＜0.01）;与10 μmol/LZEA组相比,ZEA+DON组的CCL12表达极显著上升（P＜0.01）,迁移至下室的单核巨噬细胞数及NO含量显著下降（P＜0.05）;与1 μmol/LDON 组相比,ZEA+DON 组的 MCP-1 表达极显著下降（P＜0.01）,CCL12表达极显著上升（P＜0.01）。与对照组相比,LTA组TLR2、MyD88基因及蛋白表达、TLR2/NFκB通路TRAF6、p-TAK1蛋白表达及IκBα、NFκB磷酸化水平均极显著上升（P＜0.01）,且细胞核内NFκB荧光强度增强;与LTA组相比,不同浓度ZEA、DON组及 ZEA+DON 组 TLR2、MyD88 基因及蛋白表达、TLR2/NFκB 通路 TRAF6、p-TAK1蛋白表达及IκBα、NFκB磷酸化水平均显著或极显著下降（P＜0.05或P＜0.01）,细胞核内NFκB荧光强度均减弱;与10 μmol/L ZEA、1μmol/L DON组相比,ZEA+DON组TLR2、MyD88基因及蛋白表达、TLR2/NFκB通路TRAF6、p-TAK1蛋白表达和IκBα、NFκB磷酸化水平均无显著差异（P＞0.05）。以上结果表明,ZEA、DON及联合均能抑制LTA诱导的肝细胞TLR2/NFκB通路相关蛋白表达,导致趋化因子及NO表达下降,但毒素联合不呈现协同作用。3.ZEA、DON及联合对单增李斯特菌感染小鼠肝脏免疫应答的影响以C57BL/6小鼠为研究对象,将90只雌性SPF级小鼠适应饲养一周后随机分为5组,每组18只,分别为对照组、李斯特菌组（Listeria组）、ZEA+李斯特菌组（ZEA组）、DON+李斯特菌组（DON组）、ZEA+DON+李斯特菌组（ZEA+DON组）。连续14 d对小鼠进行毒素灌胃,并在试验第8 d,除对照组外,其余组小鼠均尾静脉接种李斯特菌。在细菌感染第3、5、7 d取小鼠肝脏,检测肝脏病理变化及细菌载量,qRT-PCR检测肝组织内趋化因子MCP-1、CCL7及CCL12的表达,试剂盒及Western Blot检测肝组织NO含量及NOS2蛋白表达,qRT-PCR检测TLR2、MyD88基因表达,Western Blot检测TLR2、MyD88及TLR2/NFκB通路相关蛋白表达。结果显示,ZEA、DON及联合能加重李斯特菌感染后肝损伤,且随着时间增加损伤更加严重,与Listeria组相比,ZEA、DON及ZEA+DON组肝脏细菌载量均极显著上升（P＜0.01）。与对照组相比,细菌感染第3、5、7 d Listeria组趋化因子表达、NO含量及NOS2蛋白表达均极显著上升（P＜0.01）;与Listeria组相比,ZEA、DON及ZEA+DON组趋化因子表达、NO含量及NOS2蛋白表达均显著或极显著下降（P＜0.05或P＜0.01）。与对照组相比,细菌感染第3、5、7 d Listeria组TLR2、MyD88基因及蛋白表达、TLR2/NFκB通路TRAF6、p-TAK1蛋白表达及IκBα、NFκB磷酸化水平均极显著上升（P＜0.01）;与Listeria组相比,ZEA、DON及ZEA+DON组TLR2、MyD88基因及蛋白表达、TLR2/NFκB通路TRAF6、p-TAK1蛋白表达及IκBα、NFκB磷酸化水平均显著或极显著下降（P＜0.05或P＜0.01）。此外,与体外结果相一致,ZEA+DON组试验结果并未呈现协同作用。以上结果表明,ZEA、DON及联合均能抑制小鼠肝组织内TLR2及MyD88的表达,并抑制TLR2/NFκB通路,下调趋化因子及NO表达,加重细菌在肝脏中的感染,但毒素联合不呈现协同作用。结论:ZEA、DON均能降低肝细胞TLR2及MyD88表达,并通过抑制TLR2/NFκB信号通路,导致肝细胞在机体发生李斯特菌感染时所发挥的关键免疫功能被抑制,使得细菌在肝脏中感染加剧;ZEA与DON联合不呈现协同作用。