水稻苹果酸脱氢酶基因OsMDH的功能研究

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苹果酸脱氢酶(Malate dehydrogenase,MDH)催化苹果酸和草酰乙酸的相互转化,维持两者的动态平衡,是C4光合途径关键酶之一,也是植物体内最为常见的强氧化还原酶,同时参与到植物体各种代谢途径并起着重要的作用,如调节三羧酸循环、乙醛酸循环、氧化还原平衡和参与到细胞质和细胞器之间物质的转换等代谢过程。在香蕉树、苹果树、玉米、大白菜、黑麦等植物中,苹果酸脱氢酶基因参与对盐胁迫、冷胁迫、铝胁迫等逆境的响应。水稻苹果酸脱氢酶基因(OsMDH,LocOs08g44810)在铁离子、铝离子的胁迫下转录水平明显上升,然而其功能和生理作用还不清楚。为此,本研究以水稻“日本晴”野生型(WT)、OsMDH功能缺失型(osmdh-1与osmdh-2)、OsMDH过量表达转基因株系(OsMDH-OX-1与OsMDH-OX-2)为材料重点研究以下内容:通过外源施加高浓度铁离子处理水稻幼苗,研究该基因响应铁离子胁迫的生理机制;通过启动子融合GUS报告基因,分析OsMDH表达模式;通过转录组、代谢组、及两者关联分析,研究其潜在的下游信号途径。研究主要结果如下:(1)OsMDH能促进植株生长、提高对铁离子胁迫的耐受性。与野生型(WT)相比,osmdh-1与osmdh-2发育迟缓,主根平均根长、根数、鲜重较低,而OsMDH-OX-1与OsMDH-OX-2长势良好,主根平均根长、根数、鲜重较高。这表明OsMDH对水稻生长发育有着重要作用。外源施加高浓度铁离子处理7 d,osmdh-1与osmdh-2的两个株系主根的平均根长分别降低了 8.3%、6.7%,平均根数降低了 8.5%、15.2%,同时鲜重分别降低了 20.4%、16.1%。水稻抗氧化相关酶的活性分析表明,经铁离子处理3d后,WT、OsMDH-OX-1和OsMDH-OX-2的MDA含量没有显著性变化,osmdh-1、osmdh-2的 MDA 含量分别升高了 34.6%、55.1%;OsMDH-OX-1、OsMDH-OX-2的POD 活性显著升高了 17.6%、32%,osmdh-1、osmdh-2的POD活性没有明显变化;OsMDH-OX-1和OsMDH-OX-2的CAT 活性分别升高了 15.8%、33.8%,osmdh-1、osmdh-2和WT 的SOD、CAT活性均明显下降,OsMDH基因过表达提高了水稻对铁离子胁迫耐受性。(2)OsMDH是一个全局表达基因。通过OsMDH启动子融合GUS报告基因构建osmdh-1、osmdh-2,选取其组织器官进行染色,利用树脂半薄切片、冷冻切片等技术处理材料,在光学显微镜下观察并分析。结果表明,OsMDH在根、茎、叶、小穗和籽粒中均有表达,但各部分表达不均,其中叶肉组织,根的中柱、中柱鞘、内皮层、根冠;茎的韧皮部维管束鞘细胞;小穗的颖片、内部子房、花柱、浆片和小穗转录表达较高。(3)水稻基因OsMDH参与氧化还原反应等抗逆相关基因的转录表达。转录组测序结果表明,WTVSOsMDH-OX有206个差异基因,其中113个基因表达量分析结果呈现上调,93个基因下调。差异基因GO功能富集主要集中于三个条目:对含氧化合物、无机化合物和活性氧的响应;其KEGG通路功能分析结果显示,差异基因富集到30条通路,显著富集10条,包括淀粉和蔗糖代谢、丙酮酸代谢、半乳糖代谢、抗坏血酸和醛酸盐代谢、谷胱甘肽代谢、植物激素信号转导等过程。与响应氧化物质和活性氧的相关基因:BZIP12(BZIP 转录因子)、ZFP36、OsGA20ox2(GA 20-oxidase 2)、OsERF#076(乙烯反应因子2)上调,APX2、OsDHAR1、OsGSTU11基因下调。(4)OsMDH可能通过水杨酸代谢途径提升植物的抗逆性。过量表达OsMDH基因的水稻具更高耐铁离子胁迫能力,进一步代谢组测序分析,结果显示WTVSOsMDH-OX有58个差异代谢物具显著性,10个代谢物上调,48个代谢物下调。苯丙氨酸、谷氨酸代谢、氧化磷酸化等途径代谢物显著上调。差异代谢物富集11条KEGG通路。其中水杨酸的合成途径之一的苯丙氨酸解氨酶途径中的苯甲酸、水杨酸、肉桂酸、苯丙氨酸各物质在OsMDH-OX植株中显著上调。
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