[研究背景]醒脑静注射液(xingnaojing injection, XNJI)是古方安宫牛黄丸按现代工艺精制而成的中药静脉制剂,主要成分有麝香,郁金,栀子,冰片等。具有解毒止痛,清热凉血,醒脑开窍等功效,是临床急救中经常用到的中成药。目前研究表明XNJI能抑制蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)后的脑血管痉挛,并且能够减轻脑组织的缺氧缺血,可以显著提高昏迷患者的清醒率,对脑组织的护作用效果确切,目前醒脑静注射液已广泛应用于临床上神经系统疾病中的急、危、重症患者抢救和治疗,并且目前已经常应用蛛网膜下腔出血的治疗中。细胞凋亡(apoptosis),又称为程序性死亡,凋亡的起点是细胞内caspase激活,由功能完整的细胞膜包裹死亡细胞的内容物形成凋亡小体(apoptotic bodies)。凋亡小体被体内的巨噬细胞吞噬,通常不伴有炎症的且无死亡细胞内容物疏漏者,称为生理性细胞死亡,又被叫做细胞自杀。凋亡对多细胞动物的自身稳定和机体的发育都起着非常重要的作用。现有的研究已证明,很多疾病的发生发展和凋亡机制异常密切相关。根据目前的证据认为,细胞内存在着凋亡基因直接控制着细胞凋亡是否发生和发展方向。而细胞外部的因素可以通过信号转导从而影响这些凋亡基因的表达或者凋亡基因表面表达产物的活化,间接地调控细胞凋亡的发生和发展。目前,对于凋亡机制的研究有很多,而且已经证明细胞的种类不同和细胞处于不同生长发育阶段时,细胞的凋亡途径也不相同,然而,这种不同主要表现在早期诱发细胞凋亡的分子机制的差别很大,但是,凋亡发生一经开始,各种不同的早期凋亡信号都将汇集到一条共同的执行通路上来,从而引起细胞产生几乎相同的形态学和生物化学的特征性改变。Caspase-3是Caspase家族中的非常重要一个基因,已经被证实该基因处于各个共同执行通路的下游,是各种凋亡通路中处于下游的共同的效应部分,该基因可以直接或间接的酶解一系列细胞生存所必需的蛋白,从而起促进细胞的凋亡的作用。Bcl-2蛋白基因家族在抑制细胞的凋亡的过程中也起到不可或缺的作用,是一个至关重要的凋亡抑制基因,Bcl-2蛋白可以直接通过控制线粒体外膜的通透性来调控凋亡信号的转导。Bax也是一个非常重要的促进细胞凋亡的基因,它通过与另外的Bax形成同源二聚体从而诱导细胞凋亡,然而Bcl-2与Bax相结合形成的异源二聚体却可以对凋亡起抑制作用。Bcl-2/Bax的比值可以看作一个平衡体系,Bax表达过度对细胞凋亡起加速作用,Bcl-2表达过度则对细胞凋亡起减速作用,因此推断,Bcl-2/Bax之比决定细胞凋亡的发展方向。随着全球糖尿病发病率的逐年上升,伴随糖尿病而发生的蛛网膜下腔出血也呈增长趋势。对这类蛛网膜下腔出血病人寻求切实可行的治疗方法成为摆在医务工作者面前的一项艰巨的任务。建立稳定的糖尿病蛛网膜下腔出血模型就显得至关重要。本实验通过STZ腹腔注射的方法建立糖尿病模型,然后采用枕大池内两次新鲜自体动脉血注入的方法建立糖尿病大鼠蛛网膜下腔出血模型。通过观察造模后的死亡率和死亡大鼠的死亡时间探讨糖尿病对蛛网膜下腔出血大鼠的预后的影响。然后进一步应用醒脑静对糖尿病SAH大鼠进行干预,观测海马神经元凋亡的情况,探讨糖尿病SAH大鼠海马组织凋亡相关因子Caspase-3、Bax、 Bcl-2表达的变化以及应用XNJI干预后对上述因子变化的影响,旨在为临床上治疗伴有糖尿病病人SAH后的脑损伤提供实验理论依据。第一部分糖尿病蛛网膜下腔出血建模的对比研究目的：探讨糖尿病对蛛网膜下腔出血(SAH)后大鼠预后的影响。材料和方法：1.实验材料随机抽取63只体重在250-300g雄性成年Wistar大鼠,动物均由山东大学实验动物中心提供。饲养条件为室温18～25℃,环境相对湿度为50%～80%,自由饮水饮食。适应性喂养1周。实验组健康成年雄性大鼠高糖高蛋白喂养1个月。2.实验方法随机分为2组,糖尿病SAH组42只、SAH大鼠对照组21只。应用链脲佐菌素(Streptozocin, STZ)腹腔注射的方法建立糖尿病大鼠模型,然后采用两次枕大池内新鲜自体动脉血注入的方法建立糖尿病大鼠蛛网膜下腔出血模型。10%的水合氯醛溶液400mg/kg腹腔内注射。麻醉完全后,备皮颈背部及腹股沟区的皮肤,先取俯卧位,将大鼠固定在立体定位仪上,消毒颈背部手术区的皮肤,沿中线剪开皮肤,之后钝性分离皮下组织和肌肉层直至充分暴露寰枕膜。然后将大鼠仰卧位固定于动物固定架上。先消毒右侧腹股沟区的皮肤,沿腹股沟剪开皮肤,钝性分离皮下组织及股动脉直至股动脉充分暴露。抽取0.4mL新鲜动脉血备用。于近心端迅速结扎股动脉。穿刺寰枕膜,小心抽出脑脊液0.1mL后,将0.3mL自体新鲜动脉血缓慢注入枕大池,时间限制在2min内。然后逐层缝合颈背部及腹股沟区。保持头低位30°,30min。使血液均匀分布于脑基底池。48h后同样方法另侧股动脉抽血0.3mL枕大池注入。结果：糖尿病SAH组大鼠死亡33只,死亡率为78.57%；SAH组死亡4只,死亡率为18.09%。0～24h、24～48h、48～72h三个时间段的死亡数明显大于SAH对照组,有统计学意义。72～96h段的死亡数与SAH对照组相比,无明显统计学意义。结论：糖尿病可以明显增加蛛网膜下腔出血后大鼠的死亡率。尤其可以明显增加糖尿病大鼠72h内的死亡率。第二部分糖尿病大鼠蛛网膜下腔出血后海马组织中Caspase-3、 Bax和Bcl-2表达及醒脑静干预的研究目的：探讨糖尿病大鼠蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)后海马组织凋亡相关因子Caspase-3、Bax、Bcl-2表达的变化以及应用醒脑静注射液(xingnaojing injection, XNJI)干预后对上述因子变化的影响。材料和方法：1.实验材料设计成年雄性Wistar大鼠28只,体质量在250～300g,动物均由山东大学实验动物中心提供。饲养条件为室温18～25℃,环境相对湿度为50%～80%,自由饮水饮食。适应性喂养1周。健康成年雄性大鼠高糖高蛋白喂养1个月,实验组饲喂高糖高脂饲料。2.实验方法大鼠随机分为空白对照组、糖尿病大鼠对照组、糖尿病SAH组、XNJI治疗糖尿病SAH组(XNJI治疗组),共4组,每组7只。应用链脲佐菌素(Streptozocin, STZ)腹腔注射的方法建立大鼠的糖尿病模型,然后采用新鲜自体动脉血于枕大池内两次注入的方法建立糖尿病大鼠蛛网膜下腔出血模型。10%的水合氯醛溶液腹腔内注射(400mg/kg)。待大鼠麻醉完全后,备皮颈背部及腹股沟区的皮肤,将大鼠取俯卧位固定于立体定位仪上,常规消毒颈背部手术区皮肤,先沿中线剪开皮肤,之后钝性分离皮下组织及肌肉层直至至充分暴露寰枕膜。然后取仰卧位将大鼠固定于动物固定架上。消毒右侧腹股沟区皮肤,沿腹股沟剪开皮肤,钝性分离皮下组织及股动脉直至股动脉充分暴露。抽取0.4mL新鲜动脉血备用。于近心端迅速结扎股动脉。穿刺寰枕膜,小心抽出脑脊液0.1mL后,将0.3mL自体新鲜动脉血缓慢注入枕大池,时间限制在2min内。然后逐层缝合颈背部及腹股沟区。保持头低位30min。使血液均匀分布于脑基底池。48h后同样方法另侧股动脉抽血0.3mL枕大池注入。48h后取脑。最后用Real-Time PCR技术检测Caspase-3和Bax以及抗凋亡因子Bcl-2的变化情况。并用Western blot技术验证此变化趋势。结果：与空白对照组相比糖尿病大鼠SAH后海马组织中的Caspase-3(7.80±2.33vs2.06±0.72)和Bax(7.69±2.55vs2.09±0.51)的表达均有不同程度上升(P<0.01,P<0.01),Bcl-2(5.99±2.69vs3.41±1.47)也有所上升(P<0.05)、 XNJI治疗糖尿病大鼠SAH组中Caspase-3(4.92±1.85vs7.80±2.33)和Bax(5.05±1.36vs7.69±2.55)的表达较糖尿病大鼠SAH组表达量下降(P<0.05、P<0.05),而抗凋亡因子Bcl-2(8.35±1.37vs5.99±2.69)的表达量有所升高(P<0.05)。结论：糖尿病大鼠SAH后海马组织中有凋亡的发生,XNJI对伴糖尿病的SAH海马组织凋亡途径中的相关因子有抑制作用,对抗凋亡途径中的相关因子具有促进作用。