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目的:利用S-poly(T) PCR检测技术,对非小细胞肺癌(NSCLC)患者血浆miRNAs分阶段筛选,旨在获得对NSCLC具有早期诊断价值的miRNAs组合,为NSCLC早期诊断提供新的生物学标记。 方法:利用S-poly(T) PCR检测技术,筛选280例NSCLC患者和277例健康人血浆中特异的miRNAs。第一步,我们将126例Ⅰ期NSCLC患者血浆、154例Ⅱ~Ⅳ期NSCLC患者血浆、277例正常人血浆,各混合为一份,检测486个miRNAs的表达,筛选出在Ⅰ期或Ⅱ~Ⅳ期NSCLC患者血浆中有差异表达的126个miRNAs。第二步,将92例腺癌Ⅰ期患者血浆、108例腺癌Ⅱ~Ⅳ期患者血浆,以及34例鳞癌Ⅰ期患者血浆、46例鳞癌Ⅱ~Ⅳ期患者血浆和277例正常人血浆,各混合为一份。对第一阶段筛选出的126种miRNA进行检测,获得40个腺癌差异表达的miRNAs和42个鳞癌差异表达的miRNAs。第三步,预实验筛选出10个腺癌特异的miRNAs和9个鳞癌特异的miRNAs后,利用上述指标进一步对280例NSCLC患者血浆和277例健康人血浆做单样本验证,并利用Logistic回归分析,获得NSCLC的miRNAs早期诊断标准,同时对入选诊断标准的miRNAs的表达情况与患者临床分期进行相关性分析。 结果:通过三步筛选,并对筛选出的10个腺癌特异的miRNAs和9个鳞癌特异的miRNAs进行单样本验证,利用Logistic回归分析,miR-451a、miR-152-3p、miR-183-5p、miR-144-3p入选腺癌诊断标准(Cma);miR-152-3p、miR-139-5p、miR-550a-3p入选鳞癌诊断标准(Cms)。受试者工作曲线(ROC)分析显示,腺癌诊断标准中的4个miRNAs的ROC曲线下面积(AUC)为0.592-0.803,灵敏度为35.2-60.2%,特异度为82.2-93.3%;而由miR-451a、miR-152-3p、miR-183-5p、miR-144-3p组合的Cma检测腺癌的AUC为0.935,灵敏度为79.6%,特异度为97.8%,诊断价值比任一单基因高。另一方面,miR-152-3p、miR-139-5p、miR-550a-3p诊断鳞癌的AUC为0.515-0.870,灵敏度为41.8-74.7%,特异度为72.2-96.7%;而由这3个miRNAs组成的鳞癌诊断标准Cms对鳞癌的诊断价值可提高至AUC0.981,灵敏度92.4%,特异度91.1%。相关性分析显示Cma及Cms均与腺癌分期正相关。 结论:miR-451a、miR-152-3p、miR-183-5p、miR-144-3p联合诊断腺癌。miR-152-3p、miR-139-5p、miR-550a-3p联合诊断鳞癌,是肺癌早期诊断中具有潜在诊断价值的新的非侵入性生物标志物。 目的:由于无细胞体液临床样本中miRNAs含量较低,我们建立了基于链杂交反应(HCR)信号放大体系的miRNAs液相芯片检测方法,以解决液相芯片miRNAs检出限(LOD)较高的问题,为临床样本多重miRNAs检测奠定基础。 方法:我们设计了一种新型的发夹结构探针(探针M),它包括一段微球连接序列、一段与目标miRNA互补的序列、以及一段可引发HCR反应的序列。探针M变性退火后形成茎-环二级结构,并首先在体系中被微球被捉。当目标miRNAs存在时,体系中相应的探针M即打开其发夹结构,释放HCR引发链,从而引发两个生物素标记的茎环结构DNA单体(探针1及探针2)发生一系列的链杂交反应。随着反应进行,生物素被探针带到微球表面。当链霉素亲和素-藻红蛋白(SA-PE)被加入体系后,各微球表面即可富集到大量的荧光信号,从而实现信号放大。检测时,Luminex仪器可同时识别微球的颜色和荧光强度,从而对样本中的miRNAs进行定性及定量分析。 结果:研究结果表明,HCR信号放大策略的加入使let-7a的定量限降低到了0.1pM,灵敏度是传统液相芯片的10倍。另外,本方法还能以较高的特异性区分不同miRNAs的序列差异,并可成功运用于血浆样本的分析中。尽管如此,血浆中的复杂成分对荧光强度仍产生了轻微的抑制作用。此外,通过同时定量分析miR-21和let-7a,本方法表现出较好的多重定量能力。 结论:通过HCR信号放大体系,液相芯片对let-7a的定量限达到0.1pM级别,miRNAs的检测灵敏度提高10倍。