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第一部分基于网络药理学研究丹蛭降糖胶囊治疗糖尿病心肌病的物质基础与作用机制目的:基于网络药理学方法研究丹蛭降糖胶囊(Danzhi Jiangtang Capsule,DJC)治疗糖尿病心肌病(Diabetic cardiomypathy,DCM)的物质基础与作用机制。方法:通过中药系统药理学(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database,TCMSP)数据库获得DJC主要活性成分,对TCMSP数据库未收录的中药生地和水蛭,在知网、万方、Pubmed数据库收集其化学成分,采用Swiss Target Prediction平台预测活性成分的潜在靶点,并在GEO、Pharm Gkb、OMIM、Disgenet、NCBI Gene数据库中以“Diabetic cardiomyopathy”进行检索以获得DCM的作用靶点。利用String数据库和Cytoscape 3.7.2软件构建蛋白质交互作用网络。采用R语言对DJC治疗DCM作用靶点进行GO和KEGG分析。通过Auto Dock Tools 1.5.6软件将DJC中活性成分与重要的靶蛋白进行分子对接。结果:(1)从DJC中筛选出52个活性成分,其中太子参12个,靶点129个;菟丝子12个,靶点206个;泽泻7个,靶点20个;牡丹皮9个,靶点230个;生地黄7个,靶点57个;水蛭11个,靶点242个。去除重复成分后DJC活性成分对应的靶点486个。(2)分别利用GSE3585数据集、Pharm Gkb数据库、OMIM数据库、Disgenet数据库、NCBI Gene数据库分别检索到DCM靶点282个、76个、15个、220个、560个,去除重复靶点,共获得863个DCM靶点。(3)DJ C治疗DCM的作用靶点128个,通过拓扑学分析筛选出12个关键药效分子和17个核心靶点,12种关键化学成分分别为槲皮素、木犀草素、山奈酚、西红花酸、芍药苷、熊果酸、异鼠李素、β谷甾醇、京尼平苷、Gardnerilin A、刺槐素、金丝桃苷;17个核心靶点分别为AKT1、TNF、IL6、IL1B、VEGFA、TP53、CASP3、JUN、EGFR、STAT3、FN1、PPARG、MYC、MMP9、PTGS2、CXCL8、CCL2。(4)经GO富集分析,这些靶点与调控基因的转录、细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、氧化应激、炎症反应等生物学功能有关。经KEGG通路富集分析,发现其可能通过P I 3 K-A k t、T N F、T L R、N L R P、H I F-1、F o x O、VEGF、MAPK、IL-17、Th17、JAK-STAT等信号通路发挥作用。(5)从PDB数据库获取的DC值前十的核心靶点蛋白信息,大部分配体与活性成分分子最低结合能≤-5.0kal/mol,说明靶点蛋白和活性成分具有较好的亲和力。结论:DJC治疗DCM具有多成分、多靶点、多途径的特点,其作用机制可能与抑制炎症反应、降低氧化应激水平、调控细胞凋亡、调节免疫应答等相关。第二部分丹蛭降糖胶囊调控PI3K/AKT/GSK-3β信号通路抑制糖尿病心肌病大鼠心肌细胞凋亡目的:基于PI3K/AKT/GSK-3β信号通路观察丹蛭降糖胶囊(DJC)对糖尿病心肌病(DCM)大鼠心功能及心肌细胞凋亡的影响。方法:90只雄性SD大鼠随机选取10只作为正常对照(NC)组,其余80只大鼠采用单次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)55mg/kg联合高糖高脂饮食建立2型糖尿病心肌病模型,最后70只大鼠造模成功,随机分为低剂量丹蛭降糖胶囊组、中剂量丹蛭降糖胶囊组、高剂量丹蛭降糖胶囊组和二甲双胍(Metformin)组、模型(MC)组,DJC低、中、高剂量组按成人6g/d的等效剂量的0.5、1、2倍(270、540、1080mg/kg)灌胃处理;Metformin组给予二甲双胍按150mg/(kg.d)剂量灌胃处理;模型组(MC)组和NC组给予等容量蒸馏水灌胃处理,每组各14只,分别于药物干预后0、2、4、6、8w监测各组大鼠体重、饮水量、摄食量和随机血糖水平。干预8周后,麻醉状态下取材。取血清和心肌组织,检测大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C;采用HE染色和Masson染色法观察心肌组织病理学变化;超声心动图检测各组大鼠心功能;蛋白免疫印迹法检测心肌组织PI3K/AKT/GSK-3β信号通路关键蛋白表达水平;TUNEL免疫荧光染色法检测心肌细胞凋亡水平。结果:(1)DCM模型大鼠出现了典型的“多饮、多食、多尿、体重降低”症状,精神萎靡,动作笨拙,毛发粗糙;DJC和二甲双胍均能够显著增加体质量,降低饮水量和随机血糖水平,改善DCM大鼠一般状况。(2)与NC组比较,MC组大鼠血清TC、TG、LDL-C含量显著升高,HDL-C含量显著下降(P<0.01);与MC组比较,Metformin组和DJC各剂量组大鼠血清TC、TG、LDL-C含量明显下降,HDL-C含量显著升高(P<0.05或P<0.01)。(3)与NC组比较,MC组大鼠的LVEF、LVFS显著下降,LVDs、LVDd显著升高(P<0.01);与MC组比较,DJC中高剂量组和二甲双胍组的LVEF和LVFS显著升高,LVDs和LVDd显著降低(P<0.05或P<0.01)。(4)与NC组比较,MC组大鼠的HW/BW、LVM/BW显著增高(P<0.01);与MC组比较,DJC各剂量组和二甲双胍组的HW/BW和LVM/BW显著降低(P<0.05或P<0.01)。(5)与NC组比较,MC组光镜下心肌纤维走行较为紊乱,部分溶解,断裂,胞核位置不一,细胞间界限不清,间质出现纤维细胞增生。与MC组比较,二甲双胍组和DJC各剂量组光镜下心肌细胞的病变明显减轻。(6)Masson结果显示,与NC组比较,MC组大鼠心肌纤维化明显增多;与MC组比较,DJC各剂量组和二甲双胍组心肌纤维化区域有所改善。(7)与NC组比较,MC组大鼠心肌组织p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT及p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达水平显著降低(P<0.01);与MC组比较,DJC各剂量组和二甲双胍组大鼠心肌组织p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT及p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。(8)与NC组比较,MC组大鼠心肌组织单位浓度Caspase3和Caspase9活性显著升高(P<0.01);与MC组比较,DJC各剂量组和二甲双胍组大鼠心肌组织单位浓度Caspase3和Caspase9活性显著降低(P<0.05或P<0.01)。(9)TUNEL免疫荧光染色法结果显示,与NC组比较,MC组大鼠心肌细胞凋亡率显著增高(P<0.01);与MC组比较,各药物干预组大鼠心肌细胞凋亡率显著降低(P<0.01)。结论:丹蛭降糖胶囊可能通过激活PI3K/AKT/GSK-3β信号通路,增加PI3K、AKT、GSK-3β磷酸化水平,抑制糖尿病心肌病大鼠心肌细胞凋亡,改善心功能,发挥心肌保护作用。第三部分基于PI3K/AKT/GSK-3β信号通路研究丹蛭降糖胶囊对高糖诱导的H9C2心肌细胞凋亡的影响目的:基于PI3K/AKT/GSK-3β信号通路观察丹蛭降糖胶囊对高糖诱导的H9C2心肌细胞凋亡的影响。方法:通过体外实验建立高糖诱导H9C2心肌细胞损伤模型,采用MTT法观察高糖对心肌细胞活力的影响,PI3K特异性抑制剂LY294002及二甲双胍和丹蛭降糖胶囊含药血清干预后,使用WB法检测PI3K/AKT/GSK-3β信号通路关键蛋白的变化,流式细胞术检测各组H9C2细胞凋亡率,阐明PI3K/AKT/GSK-3β信号通路调节高糖诱导心肌细胞凋亡过程的病理机制,揭示丹蛭降糖胶囊干预高糖诱导心肌细胞凋亡作用及与调节PI3K/AKT/GSK-3β信号通路的关系。结果:(1)不同糖浓度(5.5、15、30、45、60mmol/L)和不同干预时间(12、24、48h),对H9C2心肌细胞存活率的观察结果显示,与正常对照组(5.5mmol/L)比,高糖模型组(30mmol/L)干预48h可显著降低心肌细胞存活率(P<0.01);(2)与正常对照组比,高糖模型组心肌细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β的蛋白相对表达量显著降低(P<0.01),同时流式细胞术检测心肌细胞凋亡率和Caspase3、Caspase9活性显著增加(P<0.01);(3)与高糖模型组比较,高糖+二甲双胍组、高糖+丹蛭降糖胶囊组、高糖+二甲双胍+LY294002组和高糖+丹蛭降糖胶囊+LY294002组心肌细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β的蛋白相对表达量显著增高,心肌细胞凋亡率和Caspase3、Caspase9活性显著降低(P<0.01);(4)与高糖+二甲双胍组比较,高糖+二甲双胍+LY294002组心肌细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β的蛋白相对表达量显著降低,心肌细胞凋亡率和Caspase3、Caspase9活性显著增加(P<0.01);(5)与高糖+丹蛭降糖胶囊组比较,高糖+丹蛭降糖胶囊+LY294002组心肌细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β的蛋白相对表达量显著降低,心肌细胞凋亡率和Caspase3、Caspase9活性显著增加(P<0.01)。结论:丹蛭降糖胶囊可能通过调节PI3K/AKT/GSK-3β信号通路,促进GSK-3β磷酸化,抑制高糖诱导的H9C2心肌细胞凋亡。