在当今社会,情感疾病如抑郁症、双向情感障碍等已是最广为存在的精神疾病。人群中约有16%的人在他们的人生当中受到一次或多次抑郁症的困扰。重度抑郁症(Major depressive disorder,MDD)是以持续的心情低落、自卑、有负罪感、焦虑、认知能力下降及其他行为症状等为主要特征的精神疾病,病情严重者有自杀倾向。毫无疑问,MDD是人类极度痛苦的表现,已成为自杀死亡的首要原因。约15%的抑郁病人死于继发疾病,MDD患者至少占全部自杀人数的90%。MDD被认为是引起其他疾病的危险因素,也是导致非致死性疾病的主要原因之一,给世界带来了沉重的经济负担。迄今,抑郁症的发病机制仍不清楚,但是可以肯定生物、心理及社会等诸多因素都与抑郁症的发病有关。据估计遗传因素占抑郁症发病因素的40-50%,其他非遗传因素如应激、病毒感染、情感伤害、神经发育异常使得抑郁症的发病机制更加复杂。情绪,认知障碍等MDD症状等是整个大脑网络系统相互作用的结果,而不是个别蛋白质、受体、或神经元等的突发病变。根据大量的实验研究结果,人们就抑郁症的分子机制提出了很多假说,如单胺类神经递质假说、下丘脑-垂体-肾上腺轴失调假说(the hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA轴)、神经营养因子假说、受体假说等,但是具体机制至今仍未不明确。目前的抗抑郁症的药物主要集中在5-羟色胺(5-HT)、多巴胺和去甲肾上腺素三个单胺神经递质系统,如三环类抗抑郁药,选择性5-HT再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitors,SSRIs),单胺氧化酶抑制剂(MAOIs)等。这些药物治疗往往集中在某一种抑郁症行为表现上,如食欲、睡眠、神经运动的改变。药物作用在关键的系统如5-HT系统一定时间内可能效果很明显,但是大脑受多个神经环路的调控,药物能够同时作用于多个系统可能对MDD或慢性疾病的恢复更加有效。目前临床一线抗抑郁药物,如SSRIs类药物氟西汀,虽然与三环类抗抑郁药相比疗效有了很大的提高,但是众多病人的耐受及疗效延迟严重影响了抑郁症的治疗。因此,探索抑郁症的发病机制以及开发起效更快疗效更好的新药已成为亟待解决的问题。目前已有大量的研究结果表明前额皮层(prefrontal cortex,PFC)与抑郁症密切相关。PFC区神经元与海马脑区、杏仁核、伏隔核等皮层下组织存在丰富的神经环路,PFC与这些脑区之间的传入或(和)传出神经元投递障碍与抑郁症的发生发展相关。神经胶质细胞对神经元具有支持、保护、营养、修复等作用。越来越多的研究结果显示星形胶质细胞功能失调与抑郁症相关。星形胶质细胞功能的发挥主要取决于细胞间通讯。星形胶质细胞通过缝隙连通道(gap junction channels,GJs)实现相邻细胞间的物质交流。前期的研究结果发现,PFC区星形胶质细胞缝隙连接功能障碍与MDD密切相关。人参(Panax ginseng C.A.Mey)是多年生五加科草本植物的根,广泛分布于我国东北、朝鲜半岛、俄罗斯等地,在东亚国家人参已有两千多年的用药历史,对心血管系统、免疫系统、中枢神经系统、癌症以及糖尿病均有疗效。至今,人参已经广泛应用于世界各地,是最广为应用的中药之一,有“万能药”之美誉。人参的活性成分主要包括多糖类、皂苷类,多肽、脂肪酸等。人参皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1,Rg1)是人参皂苷类的一种,是人参的主要活性成分之一,具有多种药理学活性。越来越多的研究结果表明Rg1有多种神经营养和神经保护作用,能增加神经祖细胞的分化能力促进神经发生。Rg1通过抑制细胞周期依赖性蛋白激-4(cyclin dependent kinase 4,CD4)等作用减轻大鼠大脑皮层β1-40淀粉样蛋白诱导的神经元凋亡。在中枢神经系统退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病的研究中,Rg1亦能通过激活胰岛素样生长因-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)发挥神经保护作用。此外,Rg1能明显缓解脑缺血再灌注损伤。近期的研究发现Rg1能通过促进神经发生、提高突触可塑性、调节HPA轴等作用发挥抗抑郁作用。Rg1能否通过PFC区星形胶质细胞GJ发挥抗抑郁作用至今仍未见报道。慢性不可预知性应激法(chronic unpredictable stress,CUS)模型始发于上个世纪八十年代末期,用于临床及临床前抑郁症的病因学研究。动物长期暴露于一系列温和、不可预知的应激,动物会出现奖赏系统受损的表现,类似于抑郁症患者快感缺失的症状,如蔗糖饮水量下降,慢性传统抗抑郁药给药治疗,能逆转上述表现,证明了该模型的有效性。目前,这种模型已被用于多种抑郁症相关神经生物学的研究。基于以上研究背景,本课题欲通过CUS法诱导大鼠抑郁模型,探讨Rg1与PFC区星形胶质细胞GJ功能之间的关系。具体研究内容如下:第一部分CUS法诱导大鼠抑郁模型的建立目的:观察Rg1对模型动物抑郁样行为学改变的影响方法:除对照组动物正常饲养外,应激动物以夹尾、噪音、禁食、倾笼45°过夜、冰水游泳、束缚、禁水、拥挤过夜、热水游泳、湿笼、孤养、24 h照明、关灯24 h等方法造模,每天随机抽取两种应激方式应激,连续应激35 d,并分别以Rg1 5,10,20 mg/kg三个剂量灌胃给药4 w,以文拉法辛为阳性对照。应激结束后,通过开场实验(Open field test,OFT)、糖水偏好实验(Sucrose preference test,SPT)、新奇摄食抑制实验(novelty suppressed feeding test,NSFT)和强迫游泳实验(forced swimming test,FST)等方法分别对动物跨越格子数、站立次数、糖水偏好度、12 min内新奇摄食抑郁潜伏期及6 min内强迫游泳静止不动时间等行为学指标进行检测,并对Rg1的抗抑郁作用进行比较和评估。结果:CUS开始前,OPT实验结果表明各组动物的跨越格子数(P=0.9108)及站立次数(P=0.9603)均无显著性差异。SPT基线检测结果显示各组动物的糖水偏好多度均在85%以上,各组之间没有显著性差异(P=0.9986)。CUS应激5 w后,应激组动物糖水偏好度下降15%以上,Rg1 5,10,20 mg/kg长期给药皆能使动物糖水偏好度达85%以上,与模型组检测结果想比较,有显著统计学意义(P<0.05)。NSFT实验检测结果显示,正常对照组摄食潜伏期平均为220.7 s,而模型组平均时间达到461.5 s,两组数据相比较,有显著统计学差异(P<0.01),Rg1 5,10,20 mg/kg及文拉法辛虽能缩短动物摄食潜伏期,但均未检测出显著统计学差异(P>0.05)。在FST实验中,与正常对照组相比较,模型组动物游泳静止不动时间延长1倍左右,与模型组相比较,Rg1 5,10,20 mg/kg长期给药明显缩短了动物的静止不动时间(P<0.01)。结论:CUS应激5 w后能引起动物出现明显的抑郁样行为学改变,抑郁模型造模成功。Rg1 5,10,20 mg/kg长期给药显著提高动物糖水偏好度和缩短动物强迫游泳静止不动时间,显示出良好的抗抑郁效果,其中以Rg1 20 mg/kg剂量组给药效果最佳。第二部分Rg1对CUS大鼠前额皮层星形胶质细胞缝隙连接功能及其相关蛋白的影响目的:研究Rg1与CUS大鼠前额皮层胶质细胞缝隙功能的关系方法:在CUS应激动物前额皮层脑定位注射小分子荧光黄染料(Lucifer yellow,LY),通过荧光显微镜观察动物术后脑组织冰冻切片,检测LY的扩散距离以及星形胶质细胞偶联数,观察Rg1 5,10,20mg/kg长期给药对LY扩散距离及细胞偶联数的影响;将CUS动物断头取脑,通多透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)观察CUS动物前额皮层星形胶质细胞缝隙连接的超微结构变化,以及Rg1 20 mg/kg长期给药对星形胶质细胞缝隙连接超微结构的影响;留取CUS动物新鲜脑组织,并分离出前额皮质区,采用蛋白免疫印迹法(Western blotting,WB)检测CUS动物前额皮层区缝隙连接蛋白Cx43的蛋白水平,观察Rg1 5,10,20 mg/kg长期给药对缝隙连接蛋白表达水平的影响,并对Cx43的表达水平与SPT及FST中动物行为学改变进行相关性分析。结果:与正常对照组相比较,CUS模型组动物的LY扩散距离缩小了约60%,Rg1 10,20 mg/kg长期给药能显著增大LY扩散距离,与模型组相比,具有显著统计学差异(P<0.001)。细胞偶联数检测结果与上述结果一致;电镜实验结果显示,CUS可引起相邻星形胶质细胞间超微结构受损,缝隙连接宽度增大,与正常对照组相比宽度增加2倍多,有明显的统计学差异(P<0.001),Rg1 20 mg/kg长期给药能明显改善缝隙连接的超微病变(P<0.001);WB实验结果表明,CUS能显著降低缝隙连接蛋白Cx43的蛋白水平(P<0.01),Rg1 20 mg/kg长期给药能有效提高Cx43的蛋白表达(P<0.05),且Cx43的蛋白水平与SPT及FST行为学表现显著相关。结论:Rg1可通过调节前额皮层星形胶质细胞缝隙连接蛋白Cx43的表达发挥抗抑郁作用。第三部分前额皮层脑定位注射缝隙连接阻断剂生胃酮(Carbenoxolone,CBX),观察Rg1给药对动物行为学及缝隙连接蛋白Cx43的影响目的:进一步验证Rg1对缝隙连接的关系方法:前额皮层脑定位注射CBX(100 mmol/L)或等量PBS作为对照,分别给予Rg1 20 mg/kg或溶剂水灌胃,每天两次。连续三天给药后开始进行SPT、NSFT及FST等行为学检测,检测方法同前。行为学实验结束后,断头取脑,留取新鲜前额皮质脑组织,进行WB检测,方法同前。结果:SPT结果显示,CBX定位注射后,动物糖水偏好度明显降低(P<0.001),与溶剂组相比较,Rg1给药能明显提高动物糖水偏好度(P<0.001);在NSFT实验中,CBX组动物平均摄食潜伏为285.3s,Rg1能明显缩短动物摄食潜伏期(P<0.001);FST检测结果显示,CBX使动物游泳静止不动时间延长40%左右,Rg1给药明显缩短了动物游泳静止不动时间(P<0.01)。在WB实验中,检测到CBX明显降低了缝隙连接蛋白Cx43的蛋白水平(P<0.05),Rg1给药显著逆转了上述改变(P<0.05)。结论:Rg1能显著逆转动物前额皮层脑定位注射缝隙连接阻断剂CBX引起的抑郁样行为学改变,并且对定位注射CBX脑区缝隙连接蛋白Cx43有明显的上调作用。