第一部分、PGRN与宫颈癌的相关性及其信号转导通路的研究　　 宫颈癌是全球范围内女性最常见的恶性肿瘤之一，仅次于乳腺癌。2008年全球估计新发宫颈癌病例52.98万，死亡病例25.51万人，其中85％新发病例在发展中国家。在我国，每年新增的宫颈癌病人达15万人左右，有大约2万名妇女死于这种疾病。宫颈癌的发病率逐年上升，并呈年轻化趋势。　　 人乳头瘤病毒（Humanpapillomaviruse，HPV）是引起宫颈癌病变的首要因素。HPV是一类无包膜的DNA病毒，属乳多空病毒科，根据其是否引起恶性病变，HPV分为两种:低危型（如HPV6和HPV11等）和高危型（HPV16和HPV18等）。高危型的HPV与宫颈癌的发生有密切的关系，尤其是HPV16和HPV18。其中E6和E7是高危型HPV感染最重要的两个癌基因，病毒基因组整合到人基因组增强了E6和E7的表达升高，E6和E7可分别抑制抑癌蛋白p53和Rb的表达，从而促进了细胞的增殖和恶性转化。　　 颗粒蛋白前体(progranulin，PGRN)是一种自分泌生长因子，最初在侵袭性小鼠畸胎瘤中被发现。PGRN是一类组织分布广泛、功能多样的生长因子，参与了早期胚胎发生、伤口修复、生长发育等多种重要的生理活动。研究表明，PGRN在多数肿瘤细胞中高度表达，在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌和肝癌等肿瘤中具有致瘤功能，乳腺癌、卵巢癌和肝癌等中PGRN的高表达与肿瘤恶化相关，子宫内膜癌和子宫平滑肌肉瘤的免疫组化分析发现PGRN水平与肿瘤的组织学分级呈正相关，表明PGRN具有用作肿瘤诊断标志物的潜力。　　 PGRN可激活典型的生长因子信号途径，包括Erk信号途径中shc和p42/44MAPK与磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途径中PI3K、蛋白激酶B/Akt和p70S6激酶的磷酸化。PGRN可启动结合素(integrin)相关信号途径中胞浆酪氨酸激酶——成簇黏附激酶(FAK)的磷酸化。在膀胱癌细胞中PGRN驱使FAK与桩蛋白和p44/p42MAPK的结合，暗示PGRN和细胞外基质信号可能存在相关性。近期，在胆管上皮癌中发现IL-6诱导的PGRN可以通过Akt依赖性的机制调控叉头状转录因子O1(forkheadtranscriptionfactorsO1，FoxO1)的活性，从而促进细胞增殖。　　 目前，PGRN在宫颈癌中的表达及功能还未见报道。本论文针对PGRN在宫颈癌中的表达，PGRN的表达对宫颈癌发生、发展的影响，以及对相关信号途径的调控做了初步的探讨。　　 一、PGRN在宫颈癌中的表达　　 本研究使用免疫组织化学法(Immunohistochemistry，IHC)检测了正常宫颈、宫颈癌组织的石蜡切片中PGRN的表达。实验结果显示，宫颈癌组织中PGRN表达明显高于正常宫颈组织。此外，使用westernblot检测了宫颈癌细胞HeLa(HPV18+)、SiHa(HPV16+)和宫颈永生化细胞H8中PGRN的蛋白水平和培养基内的分泌性PGRN的表达差异。Westernblot和Elisa检测结果发现，宫颈永生化细胞H8的胞内和分泌性PGRN表达最低，而宫颈癌细胞HeLa表达最高。　　 宫颈癌的形成与高危型HPVE6和E7蛋白密切相关，为了分析PGRN与癌蛋白E7之间是否存在相关性。本研究使用高表达HPV16-E7的人视网膜色素上皮(RPE1)细胞系，通过westernblot检测发现稳定表达HPV16-E7的RPE1细胞(RPE116E7)的PRGN的表达水平明显高于RPE1对照细胞，提示HPV16-E7可能是诱导宫颈上皮细胞中PGRN表达水平增高的关键诱导因素。　　 本研究还调查了其他诱导因素对PGRN表达的影响，发现IL-6、雌激素均可促进PGRN在宫颈上皮细胞或宫颈癌细胞中的表达。　　 上述研究结果表明，在宫颈癌组织中、宫颈癌细胞内或胞外，PGRN均存在高表达现象。在宫颈上皮细胞中，HPV16-E7、IL-6和雌激素是可能造成PGRN表达上调的诱导因素。由此推测PGRN有可能通过某些途径参与了宫颈癌的恶性转化。　　 二、PGRN对宫颈癌发生、发展的影响　　 为检测PGRN是否影响宫颈上皮细胞的细胞行为，本研究使用重组人PGRN(recombinanthumanPGRN，rhPGRN)处理H8细胞，或使用干扰RNA与表达载体分别抑制HeLa细胞与增强H8细胞内PGRN的表达水平，进而检测其细胞增殖、克隆形成、细胞迁移等能力。结果显示，外源性PGRN处理和PGRN内源性高表达均促进了永生化细胞H8的增殖活性，克隆形成和迁移的能力。而干扰PGRN表达后，宫颈癌细胞系HeLa的细胞增殖能力显著下降。　　 体内动物实验中发现，PGRN低表达可显著抑制HeLa细胞在裸鼠中的肿瘤生长能力。此外，将HPV癌基因E6/E7和Ha-ras转化的小鼠肺上皮细胞TC-1接种于PGRN基因敲除小鼠和野生型小鼠，结果显示TC-1细胞在基因敲除小鼠成瘤能力较野生型小鼠显著降低。相反，永生化宫颈上皮细胞H8接种的裸鼠，分别进行rhPGRN腹腔或瘤体注射可导致H8细胞成瘤。　　 本研究进一步检测了PGRN对抑癌基因Rb和p53的表达影响，发现H8细胞经rhPGRN刺激后，Rb和p53的表达均明显降低。　　 以上体外和体内研究均表明，PGRN可以促进富颈癌永生化细胞的生长增殖和恶性转化能力，而采用特异性siRNA干扰PGRN表达则导致富颈癌细胞HeLa的增殖能力的降低。PGRN促进宫颈上皮细胞增殖等细胞行为可能与PGRN降低p53、pRb表达有关。　　 三、PGRN对PI3K/Akt/mTOR信号途径的影响　　 PI3K/Akt/mTOR信号途径在癌症中的作用一直以来都是肿瘤相关研究的热点之一。PI3K/Akt与Erk信号均参与调控雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号途径，Akt、p70S6K以及FoxO1也均为mTOR信号途径的成员，提示PGRN激活的PI3K/Akt和Erk途径可能涉及mTOR信号途径。　　 本研究首次较为全面的检测了PGRN对PI3K/Akt/mTOR信号途径的影响，结果显示PGRN激活了宫颈上皮永生化细胞H8中Akt和mTOR的磷酸化并调控了mTORC1下游信号途径分子p70S6K、4E-BP1、FoxO1等的活性。PI3K/Akt抑制剂LY2940002的加入阻止了PGRN诱导的mTOR的激活，说明了PGRN诱导的mTOR磷酸化依赖于PI3K的活性。同时PGRN也可促进mTORC2的活性，重组PGRN处理H8细胞可诱导mTORC2下游分子Akt473位丝氨酸磷酸化，促进Akt控制的凋亡基因相关转录因子FoxO1的磷酸化和出核失活。　　 以上结果显示PGRN激活了Akt/mTOR信号途径，而Akt/mTOR信号途径影响到许多重要的细胞功能，在调控基本的细胞行为如细胞生长、增殖与存活中具有关键作用。本研究进一步证实了PGRN诱导的细胞增殖和抗凋亡等功能与PGRN激活的PI3K/Akt/mTOR信号途径具有重要的相关性，从而能部分解释了PGRN调控宫颈癌细胞增殖的原因。　　 综上所述，本研究首次提出PGRN与宫颈癌的密切相关性。初步探讨了PGRN在宫颈癌细胞中表达的诱导因素以及PGRN促进宫颈癌发生、发展的功能及其信号转导机制。本研究揭示了微环境因素对宫颈癌发病机制的影响，为包括宫颈癌在内的PGRN相关肿瘤提供了新的治疗靶位，有助于抗癌药物的优化和创新。　　 第二部分RbAp48调控富颈癌细胞放射敏感性的研究　　 宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其发病率位居妇女恶性肿瘤第2位。尤其是近年来出现全球发病年轻化趋势，严重威胁着广大妇女的健康。据WHO统计，全球每年新发宫颈癌病例50万，约80％的病例发生在发展中国家，中国约有15万人，其中每年全球的死亡病例约20万。　　 大量研究资料表明人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus，HPV）是宫颈癌发生的首要启动因子。HPV是一种无包膜的小DNA病毒，其中HPV16、18亚型对宫颈移行带具高度亲和力，与宫颈癌关系最为密切。HPV的转化基因主要包括病毒的早期基因E6和E7，该基因编码的蛋白产物与细胞生命周期的活性蛋白相互作用，使细胞分化、增殖和凋亡紊乱，诱发肿瘤的形成。　　 RbAp48，作为一种广泛存在的Rb蛋白结合蛋白，能够协同其他蛋白调节组蛋白及其核小体相关组蛋白乙酰转移酶(HDAC)复合物的构型和活性，从而抑制E2F调控基因的转录调节。我们课题组之前的研究首先报道了RbAp48是一种具有调控HPV阳性宫颈癌转化活性的重要蛋白，RbAp48在宫颈癌中低表达，在HPV阳性宫颈癌细胞系中过表达RbAp48能够抑制细胞的生长增殖及肿瘤形成，其机制与RbAp48调节HPV癌基因E6、E7、c-myc，抑癌基因Rb、p53以及Rb/E2F靶位基因的表达有关，提示RbAp48有可能作为一种HPV相关肿瘤的治疗靶位。　　 新近研究发现，RbAp48也是一种放射敏感性蛋白。在对肿瘤细胞放射敏感性相关基因的筛选中，RbAp48作为被鉴定出来的三个重要基因中的其中之一，其在放射敏感细胞系中的表达明显高于放射耐受细胞系。将RbAp48转入乳腺癌细胞系HS-578T、MDA-MB-231以及黑色素瘤细胞系MALME-3M后，能够明显增加细胞周期中放射敏感阶段G2/M的细胞比例，从而提高肿瘤细胞的放射敏感性。目前宫颈癌的治疗方法主要是手术和放疗，尤其晚期以放疗为主。与前列腺肿瘤、头颈部软组织肿瘤以及其它肿瘤类似，宫颈癌的治愈率在很大程度上取决于肿瘤细胞对放射治疗的敏感性。迄今，RbAp48与宫颈癌放射敏感性的关系尚未见报道。本研究在以往研究的基础上将重点探讨RbAp48与宫颈癌细胞放射敏感性的关系及其作用机制。　　 一、RbAp48在放射后富颈癌细胞中的表达　　 本研究将确定在宫颈癌中RbAp48是否是一种放射敏感性蛋白，即RbAp48的表达在射线照射前后是否有差别，以及这种差别是否决定细胞的放射敏感性。采用免疫印迹和实时定量PCR检测HPV阳性宫颈癌细胞SiHa、Caski和HeLa细胞在x-射线照射前后的RbAp48表达水平差异，结果显示照射后的RbAp48在mRNA水平和蛋白水平均显著升高，从而确定RbAp48在宫颈癌细胞中是放射敏感蛋白。　　 二、RbAp48对宫颈癌细胞放射敏感性的影响　　 本研究分别自抑制RbAp48和过表达RbAp48的角度，观察干预RbAp48对宫颈癌细胞生长增殖及细胞放射敏感性的影响。用pcDNA3.1-RbAp48转染SiHa、Caski和HeLa细胞后构建稳定过表达RbAp48的细胞系，用RbAp48特异的小干扰RNA和阴性对照siRNA分别转染细胞抑制细胞内RbAp48的表达。细胞接受不同剂量x-射线处理后，通过CCK-8试剂、细胞计数、平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验观察RbAp48对宫颈癌细胞放射敏感性的影响。　　 实验结果显示，RbAp48过表达能显著抑制照射处理后细胞的增殖，克隆形成和恶性程度。而抑制RbAp48的表达，则能降低射线对细胞增殖生长的抑制作用。进一步说明RbAp48确实能提高宫颈癌细胞的放射敏感性。　　 三、RbAp48提高富颈癌细胞放射敏感性的机制研究　　 有研究报道RbAp48能够明显增加乳腺癌细胞和黑色素瘤细胞细胞周期中放射敏感阶段G2/M的细胞比例，从而提高肿瘤细胞的放射敏感性。本研究将从细胞周期、细胞凋亡和肿瘤相关基因分析对RbAp48促进宫颈癌细胞放射敏感性的机制作初步探讨。采用流式细胞术分别检测过表达RbAp48、干扰RbAp48的宫颈癌细胞和对照细胞经x-射线照射前后细胞周期和细胞凋亡的变化。实时定量PCR检测照射前后各细胞中肿瘤相关基因p53，Rb和Caspase-8的表达变化。　　 实验结果显示，改变宫颈癌细胞内RbAp48的表达或单独射线处理均能一定程度的影响细胞周期和凋亡。过表达RbAp48能明显引起射线处理宫颈癌细胞的G2/M阻滞和细胞凋亡;而射线引起的宫颈癌细胞G2/M期细胞比例和凋亡细胞数的升高，在细胞内RbAp48表达被抑制后明显下降。实时定量PCR结果同样显示了过表达RbAp48或抑制RbAp48和射线处理均能够改变SiHa、Caski和HeLa细胞中的p53、Rb和Caspase-8的表达水平。但过表达RbAp48联合射线治疗更为显著的增强了p53、Rb和Caspase-8的表达水平，而干扰宫颈癌细胞RbAp48后，射线引起的p53、Rb和Caspase-8的表达升高明显受到抑制。　　 以上结果表明，宫颈癌细胞内RbAp48的表达变化能显著影响细胞照射后的细胞周期、细胞凋亡以及肿瘤相关基因的表达水平，说明RbAp48促进宫颈癌放射敏感性的作用是通过阻滞细胞周期G2/M期、增加细胞凋亡、促进抑癌基因p53和Rb以及凋亡相关基因Caspase-8的表达来实现的。　　 四、腺病毒介导的RbAp48高表达对富颈癌细胞放射敏感性的影响　　 为进一步确定RbAp48在宫颈癌放射敏感性中的生物学功能，我们构建了RbAp48重组腺病毒（Ad5-RbAp48），并进行了动物体内实验。Westernblot结果显示，Ad5-RbAp48能有效提高细胞中RbAp48的表达水平。裸鼠接种宫颈癌细胞SiHa和HeLa成瘤后，分别接受Ad5-RbAp48治疗、射线治疗和Ad5-RbAp48协同射线联合治疗，观察裸鼠体内成瘤的差异。实验结果显示，Ad5-RbAp48协同射线治疗能有效的抑制富颈癌细胞成瘤，提高治疗效果。说明腺病毒介导的RbAp48高表达明显提高了宫颈癌细胞的放射敏感性。　　 综上所述，本研究首次提出了RbAp48与宫颈癌放射敏感性之间的密切关系，并初步探讨了RbAp48提高宫颈癌细胞放射敏感性的相关机制。结果显示，x-射线能引起宫颈癌细胞系SiHa、Caski和HeLa细胞内RbAp48的表达升高，上调RbAp48表达能够促进宫颈癌细胞的放射敏感性，相反干扰RbAp48的表达后则会降低富颈癌细胞对射线的敏感性。RbAp48影响宫颈癌细胞放射敏感性的机制与细胞G2/M期阻滞，细胞凋亡和抑癌基因表达增加密切相关。裸鼠体内成瘤实验进一步证实Ad5-RbAp48协同射线治疗能有效的抑制宫颈癌细胞生长及成瘤力。以上研究为富颈癌的临床放疗联合基因治疗奠定了实验基础，有重要的实际应用价值。