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美洲商陆抗病毒蛋白(Pokeweed Antiviral Proteins,PAPs)属于Ⅰ型核糖体失活蛋白(Ribosome-Inactivating Proteins,RIP),具有 RNAN-糖苷酶的活性,能专一地从真核生物核糖体60S大亚基的28S rRNA特异位点A4324上切下一腺嘌呤,使其难与蛋白质合成的延伸因子EF-2结合,从而阻碍了细胞中蛋白质的合成。PAPs是一类天然的广谱抗病毒蛋白,能够抗多种植物和动物病毒,近年来受到广大研究者的高度关注,对其分子结构、蛋白质化学和抗病毒机制等领域进行了深入广泛的研究,为抗病毒药物的研制提供理论和原料药支撑。目前,PAPs用于抗人乙肝病毒等感染的研究已取得了长足的进展,并已展现出其在医药领域应用的广阔前景。美洲商陆抗病毒蛋白在防治植物和动物病毒感染上具有显著的效果,但前提是需要获得大量的高纯度、高活性的PAP抗病毒蛋白,由于PAPs蛋白是由不同基因在不同组织和发育阶段表达的蛋白产物,无法满足大量生产的需要,若能将此类基因克隆、构建表达载体、在大肠杆菌中表达并建立高效的变性、复性关键工艺,创新建立高灵敏度、高特异性的快速抗病毒生物活性鉴定方法,表达、筛选出高纯度、高生物活性的重组抗病毒蛋白PAP,就能摆脱时间和空间的限制,较好的满足研究与产业化需求。本文选定海南五指山美洲商陆作为基因克隆和蛋白纯化的试验材料:1、取新鲜的春季叶片,提取总RNA,采用RT-PCR技术获得五指山美洲商陆的cDNA序列,以得到的cDNA序列为模板,设计带有酶切位点的引物克隆PAP-Ⅰ基因,经测序验证无碱基突变和移码突变。2、对P4P-Ⅰ基因进行生物信息学分析,结果表明PAP-Ⅰ基因的cDNA编码区全长由942个碱基组成,信号肽位于N末端,由22个氨基酸组成,C末端的29个氨基酸作为稳定区;该基因具有PAP家族典型的保守结构域,属于Ⅰ型核糖体失活蛋白RIP;PAP-Ⅰ基因的亚细胞定位预测结果是定位于胞外(Extracellular);根据PAP-Ⅰ蛋白的理化性质推测PAP-Ⅰ蛋白的分子式为C1577H2493N4150469S14,其相对分子量为35.22 kD,等电点(pi)为8.86。理论推导其半衰期大约为30 h,不稳定参数为34.39,蛋白质性质稳定(标准:40以下为稳定蛋白)。亲水性平均数:-0.189,预测该蛋白为亲水性蛋白,其脂肪指数为90.29;PAP-Ⅰ蛋白的二级结构以无规卷曲为主,其次为延伸链结构和α-螺旋,β-转角所占比例最少;通过SWISS-MODEL软件对PAP-Ⅰ蛋白的氨基酸序列进行蛋白质三维结构的同源建模,获得其氨基酸序列的预测三维结构;对PAP-Ⅰ蛋白的氨基酸序列进行分析,结果表明PAP-Ⅰ蛋白有一个跨膜结构域;亲水和疏水性分析推测PAP-Ⅰ蛋白属于亲水性蛋白;对PAP-Ⅰ蛋白潜在磷酸化位点的分析表明,PAP-Ⅰ蛋白能够被丝氨酸激酶、苏氨酸激酶和酪氨酸激酶所磷酸化,从而实现其功能的调控。3、针对五指山美洲商陆PAP-/基因,构建了原核表达载体pET30a-PAP-Ⅰ。4、研究了 pET30a-PAP-Ⅰ在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达与纯化方法,通过实验获得了优化的诱导条件,0.6 mmol/L IPTG为最适的诱导浓度,最佳诱导时间为4 h。5、利用麦胚提取物转录/翻译偶联系统,根据美洲商陆抗病毒蛋白抗病毒机制及其具有抑制蛋白质合成的特性,建立了通过抑制荧光素酶合成的机理来鉴定重组蛋白生物活性的新技术。本方法与传统生物学抗病毒活性鉴定方法相比较,不但灵敏度和特异度高,而且快速、简便。6、以纯化的天然PAP蛋白作为抗原,采用交替使用完全佐剂和不完全佐剂的方法免疫新西兰长耳兔,最终获得高效价的多克隆抗体,克服了 PAP-Ⅰ蛋白免疫原性低的困难,为PAP表达纯化中进行蛋白鉴定提供了高效特异抗体。7、用Ni-Agarose亲和层析柱纯化目的蛋白,对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析,结果表明纯化的目的蛋白为单一条带,纯化效果良好,经SDS-PAGE和Western验证,结果表明得到的蛋白为PAP-Ⅰ蛋白。8、对表达的蛋白采用柱上循环复性的方法进行复性,通过麦胚提取物转录/翻译偶联系统来鉴定重组蛋白的活性,0.2 μg复性后的重组蛋白对荧光素酶表达的抑制率为84.1%;1.2μg复性后的重组蛋白对荧光素酶表达的抑制率可以达到99.9%,显现出较强的抑制蛋白质合成的活性。综上所述,本研究建立了 PAP-Ⅰ蛋白的原核表达、纯化技术,高效重组PAP的变性、复性关键技术和重组PAP的蛋白定量检测和生物活性检测技术,为抗病毒药物的研制和产业化提供了技术和原料的支撑。