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背景和目的:动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种动脉血管进行性堵塞的慢性疾病。AS作为多种心脑血管疾病发生的病理基础,目前其已经成为世界范围内引起死亡的主要原因之一。世界卫生组织数据显示在2008年全球有将近1730万患者死于心血管疾病,而到2030年,因心血管疾病死亡的人数将增加至2330万。因此,积极探讨AS发生与发展的具体机制对AS相关性疾病的防治具有重要的指导意义。泡沫细胞的形成是AS病变发生与发展过程中至关重要的病理事件。AS病变过程中泡沫细胞主要来源于巨噬细胞及血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)。酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(Acyl-coenzyme A:cholesterol acyltransferase 1,ACAT1)是细胞内一种可将游离胆固醇转变成胆固醇酯的酶,其在AS病变中泡沫细胞的形成过程中发挥重要的作用。ACAT1在人体内表达比较广泛,例如其在巨噬细胞和VSMC的内质网上均有表达。目前关于ACAT1参与巨噬细胞源性泡沫细胞形成的机制研究有很多,其中一个被广泛接受的机制是炎症反应通过上调ACAT1的表达促进巨噬细胞内脂质聚积,最终导致泡沫细胞的形成。然而,相比巨噬细胞而言,目前关于平滑肌源性泡沫细胞形成的具体机制研究很少,尤其是ACAT1是否参与了平滑肌源性泡沫细胞的形成过程仍不清楚。AS病变的发生与发展涉及多个复杂的病理过程,受多种信号通路的调节,其中慢性炎症反应是AS病变发生与发展的一大病理基础。Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)是启动免疫和炎性反应的重要膜受体,其在体内引发炎症反应方面发挥至关重要的作用,有研究显示其参与AS病变的发生与发展过程。例如最近有研究发现过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)可通过影响TLR4介导的炎症反应抑制血小板衍生的生长因子诱导的VSMC增殖与迁移。此外,也有研究发现肺炎衣原体可以通过干扰PPARγ激活上调细胞内ACAT1表达,进而促进低密度脂蛋白引起的巨噬细胞源性泡沫细胞形成。而需要注意的是肺炎衣原体的细胞膜中主要成分是TLR4的特异性配体脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),其与TLR4结合后可以触发炎症反应的激活,诱导炎性细胞因子表达,如白介素-1(interleukin-1)、il-6和肿瘤坏死因子α(tumournecrosisfactorα,tnf-α)。以上研究结果提示了我们pparγ、tlr4和acat1在泡沫细胞形成中的重要作用,因此,基于以上研究我们假设pparγ可以通过干扰tlr4介导的炎症反应进而下调acat1的表达,最终抑制平滑肌源性泡沫细胞的形成。材料与方法:本研究分为在体实验和离体实验两大部分。c57bl/6j背景野生型(wt)小鼠、apoe基因敲除(apoe-/-)小鼠、tlr4基因敲除(tlr4-/-)小鼠和acat1基因敲除(acat1-/-)小鼠被应用于在体实验;原代培养的vsmc来源于c57bl/6j背景wt小鼠、acat1-/-小鼠和tlr4-/-小鼠,被应用于离体实验。1.应采用苏木精-伊红(he)染色法确定小鼠主动脉粥样硬化斑块的形成情况;2.应用油红o染色法检测离体vsmc泡沫细胞形成情况;3.应用酶法测定法检测离体vsmc内总胆固醇含量;4.应用含有acat1cdna的腺病毒载体转染离体vsmc上调细胞中acat1的表达;5.应用tlr4配体lps和tlr4抑制剂eritoran分别上调和下调离体vsmc中tlr4表达;6.应用髓样分化因子88(myeloiddifferentiationfactor88,myd88)和核因子κb(nuclearfactor-kappab,nf-κb)的sirna化学片段转染离体vsmc,下调细胞内myd88和nf-κb表达;7.应用过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisomeproliferator-activatedreceptorγ,pparγ)配体罗格列酮(rosiglitazone,rsg)和pparγ抑制剂gw9662分别上调和下调离体vsmc中pparγ表达;8.应用酶联免疫吸附实验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)检测在体及离体il-1β、il-6和tnf-α表达;9.应用免疫印迹(westernblot)检测tlr4、myd88、nf-κbp65、磷酸化的iκbα(phosphorylatediκbα,p-iκbα)和acat1的表达;此外,免疫荧光技术也被用于检测离体vsmc中acat1的表达;结果:1.acat1在as斑块形成和oxldl诱导的平滑肌源性泡沫细胞形成中的作用⑴.高脂(highfat,hf)饮食显著上调apoe-/-小鼠主动脉acat1的表达,并导致apoe-/-小鼠主动脉形成明显的as斑块。而对于apoe和acat1双基因敲(apoe/acat1-/-)小鼠,hf饮食并不能有效诱导其as斑块的形成。⑵.oxldl呈时间依赖性的上调离体培养vsmc中acat1的表达,在第48h达到顶峰。此外,oxldl刺激导致体外培养vsmc发生泡沫化。acat1高表达进一步促进oxldl引起的vsmc中脂质堆积,而acat1缺乏显著抑制oxldl引起的vsmc中脂质堆积。2.tlr4在as斑块形成和oxldl诱导的平滑肌源性泡沫细胞形成中的作用⑴.hf饮食显著上调apoe-/-小鼠主动脉中tlr4及炎性细胞因子的表达,包括il-1β、il-6和tnf-α,同时促进apoe-/-小鼠as斑块形成。而对于apoe/tlr4-/-小鼠,hf饮食不能诱导炎性细胞因子的表达和as斑块形成。⑵.oxldl呈时间依赖性的上调离体培养vsmc中tlr4的表达,最大效应在24h时出现,且同时应用oxldl与lps可进一步增加vsmc中tlr4的表达。此外,oxldl显著促进炎性细胞因子包括il-1β、il-6和tnf-α的表达,且lps可进一步增强以上效应。在wt型vsmc中应用lps激活tlr4可进一步增加oxldl引起的脂质蓄积。而对于tlr4-/-型vsmc,oxldl与lps并不能显著增加vsmc中的脂质蓄积,且二者也不能有效上调炎性细胞因子的表达。3.tlr4与acat1在调节as斑块形成和平滑肌源性泡沫细胞形成中的关系⑴.hf饮食可显著上调apoe-/-小鼠主动脉中acat1的表达,而对于apoe/tlr4-/-小鼠,hf饮食并不能有效地上调其主动脉中acat1的表达。⑵.在wt型vsmc中激活或抑制tlr4可分别促进和抑制由oxldl引起的acat1表达上调。而对于tlr4-/-型vsmc,oxldl和lps刺激均不能有效上调acat1表达。⑶.在wt型vsmc中激活和抑制tlr4表达可分别促进和阻碍oxldl诱导的泡沫细胞形成。然而,acat1缺陷会损害以上tlr4效应;对于acat1缺陷的vsmc,tlr4激活或抑制对泡沫细胞的形成没有明显的影响。而acat1缺陷并不影响vsmc中tlr4的表达。⑷.oxldl单独应用或联合lps刺激可显著上调wt型vsmc中myd88、nf-κbp65和p-iκbα的表达水平。而对于tlr4-/-型vsmc,oxldl和/或lps刺激并不能有效地诱导myd88、nf-κbp65和p-iκbα的表达。myd88缺陷损害oxldl和/或lps诱导的nf-κbp65、p-iκbα和acat1的表达。nf-κbp65缺陷也损害oxldl和/或lps诱导的acat1的表达。4.pparγ在as斑块形成和oxldl诱导的平滑肌源性泡沫细胞形成中的作用⑴.激活PPARγ可显著抑制HF饮食喂养的ApoE-/-小鼠AS斑块的形成。此外,ApoE-/-小鼠主动脉中由HF饮食诱导的TLR4、炎性细胞因子和ACAT1的表达也被PPARγ激活所显著抑制。与此相反,激活PPARγ对Apo E/TLR4-/-小鼠AS斑块的形成及炎性细胞因子和ACAT1表达无明显影响。此外,TLR4缺陷并不影响体内PPARγ的表达。⑵.在WT型VSMC中激活或抑制PPARγ可分别抑制或促进由ox LDL引起的细胞内脂质聚积。而在TLR4-/-型VSMC中,无论是激活PPARγ还是抑制PPARγ,对VSMC泡沫化无明显影响。此外,PPARγ活化和抑制可分别抑制和促进WT型VSMC中TLR4、炎性细胞因子、MyD88、NF-κB p65、p-IκBα和ACAT1的表达水平。而对于TLR4-/-型VSMC,PPARγ活化和抑制并不能有效地影响TLR4介导的炎症反应和ACAT1的表达。同时,和体内PPARγ的表达一样,TLR4缺陷并不影响PPARγ的表达。结论:本研究提供的证据显示在AS病变过程中ox LDL刺激可以通过激活TLR4/MyD88/NF-κB炎症信号通路上调VSMC中ACAT1的表达,并最终促进平滑肌源性泡沫细胞的形成。此外,PPARγ可以通过抑制上述炎症信号通路抑制ox LDL诱导的平滑肌源性泡沫细胞的形成。我们的研究阐明了PPARγ、TLR4和ACAT1在平滑肌源性泡沫细胞形成过程中的病理作用,为AS防治提供了潜在的干预靶点。