论文部分内容阅读
阿尔茨海默病(AD)是一种临床表现为进行性认知衰退的神经系统退行性疾病,近年来,AD是全球内最为常见的一种痴呆性疾病。目前,阿尔茨海默病的起因及发病机制尚不太清楚,AD患者大脑中出现的由β-淀粉样蛋白(Aβ)组成的老年斑和tau蛋白磷酸化形成的神经纤维缠结,成为AD发病机制中两种典型的病理特征。现存在众多解释AD发病机制的理论,如淀粉样蛋白沉积,神经细胞凋亡或丢失,氧化应激,内质网应激,线粒体功能障碍,炎症等。红茶中茶黄素单体被报道具有较多功能活性,尤以茶黄素(TF1)、茶黄素-3-没食子酸酯(TF2A)、茶黄素-3’-没食子酸酯(TF2B)和茶黄素双没食子酸酯(TF3)四种单体为主。本论文从体内外实验系统研究了茶黄素抑制Aβ生成,包括体内外对Aβ42本身生成量的影响,对促进Aβ生成的老年色素类荧光产物(脂质过氧化产物及非酶糖基化产物)含量的影响,对Aβ代谢通路相关基因或蛋白表达水平的影响,以及体内外对神经细胞抗凋亡和抗氧化的保护作用研究。总之,本论文从不同角度探究并展示了茶黄素对延缓AD的发展具有潜在研究和应用价值。1茶黄素对体外蛋白质羰基化及聚集纤维化抑制作用研究羰基应激是生物衰老的核心生化过程之一,本实验在体外模拟生理条件下构建蛋白质羰基化反应体系,即牛血清白蛋白(BSA)与丙二醛(MDA)反应生成脂褐素(LF),丙酮醛(MGO)与BSA反应生成糖基化终末产物(AGEs),以及Aβ42蛋白质聚集纤维化模型。通过茶黄素干预三种反应体系,探讨茶黄素对体外蛋白质羰基化及聚集纤维化的影响,结果如下:(1)本实验成功构建BSA/MDA和BSA/MGO反应体系体外模型,并筛选出最佳反应条件,分别为:MDA反应浓度为4 m M,孵育时间为2 d,MGO浓度为20 mM,孵育时间为7 d,均与1mg/m L BSA反应;以及构建Aβ42聚集纤维化模型,Aβ42浓度为30μM,孵育时间为3 d;三种体系均于模拟生理条件下(PBS缓冲液,37℃,120 r/min摇床)共同孵育。(2)不同浓度茶黄素干预BSA/MDA实验结果表明,羰-氨交联反应过程中β-sheet结构与脂褐素的生成量在一定程度上成正相关。而茶黄素茶对脂褐素和β-sheet结构生成均具有一定抑制作用,且其抑制效果存在剂量依赖关系。通过SDS-PAGE电泳和NBT染色结果发现,茶黄素能直接结合蛋白生成醌类物质,减少蛋白质纤维化过程中产生的富含β-sheet结构的毒性寡聚体,且与ThT荧光检测结果相符。经扫描电子显微镜观察,进一步说明茶黄素可直接改变蛋白质构象从而抑制蛋白质纤维化及老年斑的形成。(3)茶黄素可直接结合并作用于BSA/MGO复合体系,从而有效抑制AGEs形成,且其抑制效果与茶黄素浓度存在剂量依赖关系;不同茶黄素单体对AGEs抑制作用存在差异,TF2B和TF3抑制作用效果优于TF1和TF2A。由ThT荧光检测结果表明,茶黄素抑制蛋白质糖基化的同时也降低了蛋白质聚集水平。(4)茶黄素干预Aβ42淀粉样蛋白纤维化实验结果表明,四种茶黄素单体能不同程度降低富含β-sheet结构的毒性寡聚体,从而阻抑Aβ42纤维化沉积,其抑制效果存在剂量依赖关系,从强到弱大致排序为TF3>TF2B>TF2A>TF1。2茶黄素对神经细胞氧化损伤的保护作用研究氧化应激可通过产生大量超氧化物及羟基自由基造成神经细胞凋亡,AD的发生与发展与神经细胞凋亡及氧化应激等发病机制紧密相关。因此通过不同浓度茶黄素进行干预神经细胞氧化损伤模型实验,探讨茶黄素对神经细胞氧化损伤的保护作用机制,结果如下:(1)成功构建了由20μM Aβ42、200μM H2O2及400μg/mL AGEs诱导神经细胞(SH-SY5Y或PC12)氧化损伤模型,MTT和Hoechst 33258检测结果表明茶黄素可不同程度抑制神经细胞活力下降。(2)通过检测抗氧化酶GSH-PX和CAT活性,破坏氧化还原系统的ROS和脂质过氧化终末产物MDA等氧化与抗氧化指标,结果暗示了茶黄素拮抗神经细胞氧化损伤与其维护细胞内氧化还原系统平衡存在一定关系。(3)RT-PCR和Western blot实验检测细胞内与凋亡相关的基因或蛋白表达水平,以及AGEs受体蛋白(RAGE)表达水平,发现茶黄素可能通过降低促凋亡/抗凋亡蛋白即Bax/Bcl-2的比率,下调Caspase-3蛋白表达,以及下调RAGE表达等作用机制,从而发挥其抗细胞凋亡的神经细胞保护功能。3茶黄素对快速老化SAMP8小鼠的神经保护作用研究在以上体外实验的研究基础上,通过连续(10周)对快速老化型SAMP8小鼠(12周龄)灌胃茶黄素(剂量为10 mg·kg-1·d-1)进行体内实验研究,综合探讨茶黄素对AD动物模型(SAMP8)神经保护作用,结果如下:(1)茶黄素可显著降低血清中Aβ42、AGEs含量,与体外实验结果相一致。(2)通过透射电镜检测海马中线粒体、细胞核等细胞器变化情况;以及HE染色观察海马组织中神经元的变化;采用RT-PCR和Western blot检测脑部Bax、Bcl-2等凋亡基因或蛋白表达水平;发现茶黄素可能通过缓解线粒体功能障碍、抗神经细胞凋亡等机制对神经细胞具有一定保护作用。(3)此外,通过RT-PCR和Western blot检测Aβ代谢通路相关基因或蛋白表达情况,发现茶黄素混合物可能通过降低BACE1、PS1蛋白水平,从而减低β、γ分泌酶活性,抑制了APP裂解为Aβ途径;通过升高ADAM10蛋白表达水平,从而增强了APP通过α-分泌酶裂解成可溶性APP的裂解途径;同时,降解Aβ的NEP及IDE水平均有所上升,推测茶黄素也可促进Aβ裂解从而降低其含量及沉积。