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沙门氏菌是一种革兰氏阴性肠道杆菌,感染宿主动物后能够引发多种疾病。沙门氏菌可以通过多种致病效应分子的作用在宿主体内定殖、存活、复制,其中,Ⅲ型分泌系统在沙门氏菌致病过程中发挥极其重要的作用。该分泌系统能够分泌60多种效应分子进入宿主细胞并发挥其调节宿主细胞生物学过程的功能。SopB是由沙门氏菌SPI-1Ⅲ型分泌系统分泌的具有肌醇磷脂酶活性的效应蛋白。目前的研究发现,SopB在沙门氏菌感染宿主细胞的过程中,其时间和空间上的精确调控依赖于其泛素化修饰。基于此,通过体外活性重组技术,分离到了人肠上皮细胞泛素化修饰SopB的泛素连接酶TRAF6。
为了进一步通过体内实验确认TRAF6是能够泛素化修饰沙门氏菌SopB的泛素连接酶,我们首先通过RNA干扰技术筛选到了TRAF6高效阻断表达的Henle-407 shTRAF6细胞系。此外还利用TRAF6基因缺失的鼠胚成纤维细胞Traf6-/-做为研究模型,确认了TRAF6是人肠上皮细胞中泛素化修饰SopB的泛素连接酶。基于SopB的泛素化修饰是能够将SopB从细胞质膜定位至沙门氏菌内含小泡SCV的关键因素,进一步利用激光共聚焦技术比较了TRAF6对SopB亚细胞定位的影响,结果表明TRAF6的缺失导致SopB从沙门氏菌感染部位扩散,而不能与沙门氏菌共定位。基于上述结果,为了进一步研究SopB与TRAF6之间是否存在相互作用,我们利用免疫共沉淀技术分析发现SopB与TRAF6之间能够共沉淀,进而表明两者之间存在相互作用。TRAF6是细胞内重要的信号分子,基于SopB被发现具有多种功能,包括能够激活细胞MAPKs的磷酸化以及Akt的磷酸化等。因此我们进一步分析是否SopB的生物学功能的发挥依赖于TRAF6的活性。结果表明:TRAF6部分的介导了受SopB激活的原癌基因Akt的磷酸化。同时利用shTRAF6细胞系的研究发现TRAF6介导了受沙门氏菌感染以及LPS处理诱导的MAPKs的磷酸化激活。综上所述,TRAF6泛素化修饰沙门氏菌效应分子SopB,并且与之形成复合物介导了受SopB激活的MAPKs和Akt的磷酸化作用。